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1、第三章、生物大分子的初级分离技术,3学时,总体学习目的和要求,了解蛋白质表面特性，掌握各种沉淀和泡沫分离的原理、特点以及应用范围。,目录,引言沉淀分离蛋白质表面特性盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀热沉淀其他沉淀法沉淀生成动力学泡沫分离,一、引言学习要点,识记：初级分离概念理解：初级分离特点,初级分离概念,初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。,初级分离特点,分离对象：体积大、杂质含量高；分离技术：低操作成本、适于大规模生产,二、沉淀分离学习要点,识记：盐析和盐溶概念理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种
2、沉 淀方法的原理和影响因素应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质 的沉淀,沉淀的定义,由于物理环境的变化而引起溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象，称为沉淀。,沉淀与结晶的区别,沉淀生成的固体颗粒是不定形的结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等）沉淀的纯度远低于结晶 多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产品,沉淀技术适用范围,沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。,蛋白质表面特性蛋白质组成,蛋白质组成 20种氨基
3、酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸蛋白质折叠趋势疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区,胶体的定义,胶体是一种尺寸在1100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。-被遗忘了尺寸的世界,Wilhelm Friedrich Ostwald(1853 1932),胶体的性质,比表面增大，界面现象重要 强烈的尺寸效应,蛋白质表面特性蛋白质性质,蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子量约61000 kD
4、a，分子直径约为130 nm。在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的部分性质蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质两端及侧链中有一些解离基，解离程度受pH影响。蛋白质的变性 物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。,蛋白质表面特性沉淀屏障,蛋白质分子周围的水化层 水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层 胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力”分子间的静电排斥作用 根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四周为离子氛所包围。当两个
5、胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶粒受到斥力而相互脱离。,蛋白质表面特性沉淀策略及方法,策略 破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度 沉淀方法 改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂,蛋白质表面特性常用的沉淀技术,盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀聚合物沉淀热沉淀,盐析沉淀-学习要点,识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素 应用：掌握盐析操作过程,盐析沉淀-盐析的定义,定义 蛋白质在高离子强度
6、的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）溶解度与I的关系Cohn方程,盐析沉淀-盐析原理,低离子强度下的盐溶 向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质的溶解度增大，发生盐溶高离子强度下的盐析 溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子将把反离子压入（排斥）到双电层中 由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用,盐析沉淀-盐析原理图示,盐析沉淀-影响盐析因素,蛋白质的分子量和结构 无机盐种类和浓度 相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白
7、质的盐析效果不同 盐的种类将影响到Cohn方程中的盐析常数 盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列相符温度和pH值 在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度升高而增大 在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水化层并导致蛋白质溶解度的降低,盐析沉淀-无机盐的选择,溶解度大 可配制成具有较高离子强度的无机盐溶液 溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。,盐析操作-沉淀剂性质,对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱和浓度等），是必需的。以硫酸铵为例：20下，饱和浓度为4.05 mol/L（
8、相当于534 g/L）饱和密度为1.235 kg/L；0下，饱和浓度为3.825 mol/L（相当于505 g/L）,盐析操作-溶解度曲线确定,离心分离沉淀物并重新溶解测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度,以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线,Typical ammonium sulphate precipitation ranges for proteins from a crude extract in supernatant.()EGFP relative content in supernatant,()total protein relative c
9、ontent in supernatant,Normalized eGFP content in the precipitated pellet at different saturation of ammonium sulfate,盐析操作-无机盐加入量,硫酸铵的摩尔浓度由M1增大到M2所需要加入的硫酸铵质量W为,20,0,如果用饱和度S代替摩尔浓度M，,等电点沉淀-学习要点,理解：等电点沉淀法原理 应用：了解等电点沉淀法的优缺点和适用范围,等电点沉淀-定义,利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法,等电点沉淀原理,利用在低离子强度下蛋白质溶解
10、度较低的特性，调整溶液pH值至等电点或在等电点的pH下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。,等电点沉淀-沉淀条件,较低的溶液离子强度 溶液的pH值接近等电点,等电点沉淀-实现方式,在低离子强度下调整溶液pH值至等电点 在等电点的pH值下利用透析等方法降低溶液的离子强度，使蛋白质沉淀,等电点沉淀-操作特点,等电点沉淀在较低的离子强度下进行，因此沉淀操作结束后无需脱盐 与其它沉淀结合使用，例如在等电点附近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小的蛋白质溶解度 溶液的pH值调节方便，但过低的蛋白质等电点容易引起目标蛋白质变性,有机溶剂沉淀-学习要点,理解：有机溶剂沉淀法原理 应用：了解有机溶剂沉淀法的
11、优缺点和适用范围,有机溶剂沉淀-原理,向蛋白质溶液中加入水溶性有机溶剂：水的活度将降低有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质表面的水分子。结果：随有机溶剂浓度增大，水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生凝聚和沉淀,有机溶剂沉淀-原理图示,有机溶剂沉淀-特点,优点 有机溶剂密度较低，易于沉淀分离 与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐 缺点 有机溶剂沉淀容易引起蛋白质变性,热沉淀-学习要点,理解：了解热沉淀原理,热沉淀-原理,在较高的温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而发生凝聚和沉
12、淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，以分离出热稳定性高的目标蛋白产物,与前面介绍的热力学沉淀方法不同，热沉淀过程是基于蛋白质的变性动力学,其他沉淀技术,聚合物沉淀 非离子型聚合物沉淀 聚电解质沉淀 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质,沉淀生成动力学-沉淀生长,异向生长 发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制 同向凝聚 较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀,三、泡沫分离,识记：泡沫分离的概念理解：泡沫分离的原理、优势应用：泡沫分离的应用,泡沫分离概念,泡沫分离是根据表面吸附原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离的方法。,
