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1、实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶,一、目的要求,1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化,二、原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,内水体积Vi外水体积Vo柱床体积Vt洗脱体积VeVt=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi,Kd=0Kd=101,优点：a.条件温和 b.操作简便 c.损失少回收率高 d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：
2、聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,凝胶及柱的选择,凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。,装柱的两种方法：a.手工操作 1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床打开出水口连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9）,样品上柱分析用量：柱床体积的12%制备用量：柱床体积的1020%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,应用a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定,三、仪器的使用核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法,核酸蛋白
3、检测仪及记录仪操作方法,1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100T档。4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。,5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密
4、度A要调零，量程开关拔到100T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0”，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在0位。6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。,记录仪光吸收A读数 当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%
5、刻度)位置时即为0.25A。数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:A量程选定在0-2.0档时，数显读数2=实际光吸收读数AA量程选定在0-1.0档肘，数显读数1=实际光吸收读数A,部分收集器的操作方法,1将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开慢和“定”，再按一下停设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能
6、显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。,2定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或“顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在“顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。,移液器（俗称“枪”）的使用：,四、操作方法,（一）凝胶的选择与处理1.凝胶及柱的选择选择Sephadex G100和1.5cm60cm的柱子。2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍
7、量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。,（二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，
8、然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。,（四）加样1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪。柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。核酸蛋白检测仪的量程置于2A，记录仪量程置于10mV，走纸速度设定0.5mm/min。2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将碱性磷酸酶样品溶液2mL小心加到凝胶床面上，应避免将柱床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后凝胶
9、上方加满洗脱液，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通洗脱瓶。上样和洗脱的流速为0.3mL/min左右。（五）洗脱洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.01mol/LTris-HCl洗脱，用自动部分收集器收集流出液，每管2mL。,(六）碱性磷酸酶活力峰收集对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力测定，收集碱性磷酸酶活力峰，即为经凝胶过滤柱层析纯化的洗脱液。对合并后的碱性磷酸酶活力峰进行酶活和蛋白浓度的测定，即可得到其比活力。,五、注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。,六、思考题1.在本实验中要注意哪些重要环节？,核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）,核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）,返回,核酸蛋白检测仪,返回,记录仪,返回,部分收集器,部分收集器,返回,返回,返回,密封圈,尼龙膜,装柱示意图,返回,返回,
