目的基因的制备和基因克隆的筛选.ppt

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1、基因工程,田长恩,基因工程,1 基因工程概论,2 天然DNA的制备,3 分子克隆工具酶,4 分子克隆载体,5 表达载体,6 PCR技术及其应用,7 目的基因的制备,8 基因克隆的筛选策略,9 细菌基因工程,10 酵母基因工程,11 植物基因工程,12 动物基因工程,13 医药基因工程,14 基因工程的安全,How to amplify a target gene?,Amplification of a target gene with PCR if the sequence is known.,7 目的基因的制备 7.1 直接分离7.2 构建基因组文库分离7.3 构建cDNA基因文库分离7.4

2、 利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因7.5 基因的化学合成(自学),7.1 直接分离限制酶酶切分离法 适于从简单基因组分离目的基因，如质粒和病毒。对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制酶进 行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段即可。对定位的目的基因，根据目的基因两侧的已知限制酶识别位点，用适当酶切割，可获得目的基因。即使含目的基因的DNA分子未定序或未定位，先通过酶切分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钓出目的基因。,2）物理化学法 如果不同DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等明显不同，采用相应的方法从生物基因组分离目的

3、基因。主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。密度梯度离心法：GC含量高，浮力密度大，可用密度梯度超速离心使片段分开。然后通过与标记的mRNA杂交检验，分离基因，如非洲爪蟾rDNA和海胆组蛋白基因。单链酶解法：GC含量高，Tm值就高。据此，可通过控制Tm使富AT区变性解链，而富GC区仍维持双链状态，然后利用单链核酸酶S1酶切除单链，得到富GC的片段，经梯度离心分离。海胆 rDNA分子内GC含量高达 63，就是用此法分离得到。分子杂交法：单链DNA与其互补的序列“配对成双”后，再将非单链用单链核酸酶 S1切掉，最后经梯度离心分离。Beckwith(1969)等应用此法，成功地分离了大肠杆

4、菌乳糖操纵子的-半乳糖苷酶基因，首创了单基因分离的成功先例。,3）双抗体免疫法 此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。黄色葡萄球菌中的 protein A可以同IgG产生免疫反应而代替第二抗体，由此发展出用protein A-Sepharose 4B作为亲和层析介质，通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术，从而使双抗免疫法更有效。,多聚核糖体制备,与一抗保温,多聚核糖体-一抗,特定mRNA,不连续蔗糖梯度离心,多聚核糖体-一抗体-二抗,纯化的多聚核糖体-一抗体-二抗,去除蛋白,cDNA,4)反转录法 对于特定基因，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA，然后在 DNA聚合

5、酶的催化下合成双链 cDNA片段。这样就可以通过mRNA-cDNA-dscDNA的途径而绕过建立cDNA文库这一步，直接得到基因。,7.2 构建基因组文库分离法(第11章)高等生物的基因组DNA十分庞大，可达数万个，且基因组成结构复杂，因此，单个基因在整个基因组中所占的比例极小，除少数外，绝大多数基因难以直接分离。解决以上难题的一种可行方法就是扩增这个基因，以增加分离成功的可能性。但要分离的目的基因往往是未知基因，无法进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再用不同的方法将所需的克隆筛选出来，再分离得到目的基因。,鸟枪法克隆目的基因,早期方法，先将DN

6、A打断，与适当载体重组，转化受体菌进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，获得所要的基因。,鸟枪法的不足：采用质粒作载体，克隆能力有限，重组后的克隆多，筛选困难。噬菌体载体使可插入的外源片段长度大为增加，最大可达22 kb；而cosmid和YAC载体能容纳45 kb和上百万kb，有利于分离和筛选同一生物体内的各种基因片段。1)基因组文库的概念 通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体，即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。,2）基因组文库的大小 理想的

7、基因组文库：“全”，克隆群体包含基因组的所有DNA序列；“完整”，片段的长度要足够，含基因的完整序列，包括其侧翼序列；“重叠”，目的序列在某些克隆中有部分重叠，便于获得基因的全部序列。一般情况下，完整的基因组文库所需的克隆总数取决于外源基因组大小及切割片段大小，可用公式进行理论值的估算：,基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长片段均长 例如某生物基因组的总长为3106kb，酶切片段均长15kb，则基因组文库应含克隆子数为 310615 2105。但实际上,该基因组文库应含的克隆子数远远超过这个数。为此，Clark和Carbon(1976)提出了一个经验公式用于估算基因组文库的大小，公式如下：必

8、需的克隆的数目 N ln(1-P)/ln(1-f)P：目的片段在文库中出现的概率；f：插入片段大小/全基因组大小。如果要使文库中目的片段的出现概率达到期望值 99，即0.99，则构建上述某生物的基因组文库应包含的克隆子经验值是 N ln（1-0.99）ln（1-153106），比理论值约大 4.5倍。几类生物基因组文库大小列于表4-1。,实际上，无论采用什么方法都不能达到理论上的完全随机切割。为了使基因组文库具有真实代表性，一般构建基因组文库的实际克隆数应比上述计算值大2倍或3倍，甚至更高。,3）构建噬菌体基因组文库 包括获得含基因的DNA片段，与噬菌体克隆载体重组，转化受体菌和筛选克隆子。目

9、前较多地选用替代型噬菌体载体来构建基因组文库，其基本步骤如图所示。,BmaHI与Sau3AI是同尾酶（5GATC）,I,4)构建cosmid基因组文库 Cosmid分子小，含质粒复制起点和抗生素标记，可在大肠杆菌中复制；也含cos位点，可体外包装。重组Cosmid进入大肠杆菌后，只按质粒DNA的方式复制，所得为菌落。Cosmid作为构建基因组文库载体的优缺点 优点：能容纳更大的片段（3045 kb）；载体分子很小（5 kb），便于插入片段的限制酶图谱分析。缺点：筛选困难；重组效率低；文库不易贮存。,5)构建YAC基因组文库 噬菌体和cosmid克隆能力约为20和45 kb，对于单个基因或小基因

10、组已足够，但对于大基因组明显不够。酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）能象染色体一样在酵母细胞中复制，并可克隆长达上千kb的DNA。YAC以pBR322为骨架，具pBR322质粒的复制起点和筛选标记，还加入染色体复制必需的组分：着丝粒序列（CEN）、酵母自主复制序列（autonomusly replicating sequence，ARS）、一对端粒序列（TEL）、选择标记TRP1和URA3(酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1和ura3的野生型等位基因)、克隆位点，存在于SUP4中。当外源DNA片段插入时，该基因被隔断，使突变宿主菌落由白色转为红色

11、。构建过程如图。,丢失,7.3 构建cDNA基因文库分离(第11章)基因组庞大而复杂，从染色体DNA出发，直接克隆目的基因非常困难。高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶段的单个细胞或个体中，仅15左右的基因表达。可见由 mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA克隆是通过酶将总poly(A)mRNA转变成双链cDNA群体，插入到适当载体后转化寄主，构成某个时期或某组织中表达基因的 cDNA基因文库（图）。7.3.1 cDNA文库的构建（i）先提总RNA，再纯化mRNA。,（ii）合成第一链cDNA。Oligo(dT)引导的cDNA合成法

12、:用12 20个Oligo(dT)做引物,以mRNA为模板合成第一链cDNA，得RNA-DNA杂交分子。但是，此法从3-端开始，往往无法到达5-端。随机引物引导的cDNA合成法:利用随机610个核苷酸（混合物）为引物，从许多位点同时反转录，然后测序和重叠分析，得到mRNA全序列。（iii）将mRNA-DNA转变为双链DNA。大肠杆菌RNaseH酶识别mRNA-DNA，并将其mRNA消化成许多短片段，仍同第I链DNA杂交着，故可作为引物，以第I链为模板合成第II链。最后，用连接酶连接。（iv）将合成的双链cDNA重组到载体上，导入寄主增殖。,以质粒为载体构建cDNA文库,PCR法合成cDNA,7

13、.3.2 mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系 一个细胞中有上万种mRNA，但各种mRNA的拷贝数不同，即丰度不同,可以分为高、中和低丰度类型(表)。,估算cDNA文库大小的理论公式：文库中cDNA的克隆数=总mRNA数/某种mRNA的拷贝数 估算cDNA文库大小的经验公式:N=ln(1-p)/ln(1-f)N为cDNA基因文库克隆的数目；P为文库中含目的基因cDNA片段的出现概率，一般期望值为 99；f是某种 mRNA的丰度与总mRNA数的比值。,7.3.3 cDNA文库的优越性 第一，cDNA克隆是某些不经过DNA中间体的RNA病毒（如流感、脊髓灰质炎等病毒）基因组结构研究及有关基因的

14、克隆分离的唯一可行的方法。第二，cDNA基因文库的筛选简单易行。cDNA文库比基因组文库所含克隆数少，约为后者的1/10，甚至更少。第三，每一cDNA克隆都含有一种mRNA序列，选择目的基因出现假阳性的概率较低。第四，通过cDNA文库筛选到的目的基因克隆可在细菌中表达，获得有生物活性的蛋白质产物。第五，cDNA克隆可用于真核mRNA的结构和功能研究。,7.3.4 cDNA文库的局限性 首先，遗传信息远少于基因组文库，并受细胞来源或发育时期的影响。其次，不能直接获得内含子序列和编码区外的大量调控序列的结构与功能方面的信息。第三，低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例较低，分离也比较困难。近年来发

15、展了一些新的cDNA文库的构建方法和技术，例如，减数、标准化和染色体区域性cDNA文库的构建及目的cDNA的克隆等。这些文库的构建原则是使cDNA文库具有最大的代表性。,7.4 利用PCR 扩增目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可合成一对引物，利用PCR有效地扩增出所需片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后基因的方向正确性，常常对引物的5-端作修饰，如限制酶切点，启动子序列或起始或终止密码。经过PCR扩增后，添加的序列最终可整合到新合成的产物中，便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究(图)。,7.5 基因的化学合成(自学),8 基因克隆的筛选策略 建库后，首要任务是筛选含目的基

16、因的克隆子。依据待分离基因或其产品的有关特性，如序列、功能、染色体上的位置和mRNA等，建立相应的方法。8.1 根据功能筛选 8.2 根据序列筛选 8.3 差别杂交及减法杂交法 8.4 差别显示法 8.5 功能结合法 8.6 DNA 插入诱变法 8.7 基因定位克隆法 8.8 分子间相互作用克隆法,8.1 根据功能筛选8.1.1 特异蛋白分离法 在特异蛋白测序的基础上进行。1）根据氨基酸序列遗传密码的简并性，人工合成特异简并探针或引物，筛选或PCR扩增相应基因。2）用纯化蛋白制备抗体，再用抗体筛选。8.1.2 功能互补法 利用克隆片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的互补性直接分离目的基因。如将

17、“库”中的DNA片段分别导入突变体，找出能互补的序列片段。,8.2 序列克隆法8.2.1 已知基因序列或同源基因序列克隆法 根据已知基因或同源基因序列分离目的基因的最直接方法是用核酸探针进行杂交筛选。先从DNA序列数据库（GenBank）中查找基因序列，用以制备作探针或引物，筛选或扩增基因（图）。另，许多基因在种、属间高度保守。可用已知的同源基因制备探针或引物，筛选文库，再对阳性克隆测序，并与已知基因序列或同源性序列比对，最后经转化鉴定是否为待分离的基因。,菌落原位杂交,8.2.2 表达序列标签法 表达序列标签（expressed sequence tag，简称EST）:一段含有足够信息以显示

18、出该基因与其他基因差异的特异序列，长100 500 bp。表达序列标签法(ESTs):利用EST寻找新基因的策略。基本步骤:测序 比对 筛选、分离目的基因。局限性:找极低或不表达的基因难;不能检测出内含子序列和调控序列;基因功能待鉴定;基因序列不全。,8.2.3 基因表达系列分析法 基因表达系列分析法（serial analysis of gene expression，SAGE）的主要优点在于一次可对大量基因的转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。此法用来分离不同发育阶段和生理状态下差别表达基因，不需特殊仪器设备，只要PCR和测序。（1）原理：从转录物某一特定位置上分离得到一段9-10bp

19、的寡核苷酸序列标签（sequence tag，ST），含有确定一个独特转录物的足够信息量。理论上随机排列的9 bp片段可区分262 144（49）种转录物，而人类基因仅30 000个转录子。多个序列标签（ST）能以锚定酶（anchoring enzyme，AE，识别位点为4碱基的限制酶）识别位点序列相隔，连成双标签序列（ditag）的多联体，将该多联体序列克隆到一载体中，用连续,的方法进行多联体的序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录产物的种类和出现频率。因此，本法要求在计算机中建立一种注册和界定每个标签的方法。（2）过程：以mRNA为模板，利用连有生物素的oligo（dT

20、）作引物合成cDNA，然后以锚定酶切割,通过亲和层析分离cDNA的3端。将3端cDNA分成两等份，分别与接头A或B连接。两种接头均含一种标签酶（tagging enzyme，TE，识别位点与切割位点不一致，两者相距520 bp）的识别位点。然后以标签酶TE和锚定酶AE切割 cDNA，产生粘合TE、AE切割末端，并且都具有cDNA 910bp转录产物序列（ST）的短片段。将两部分cDNA短片段等量混合、相互连接，然后以两种接头特异的双引物A、B进行PCR扩增，形成两端含有TE、AE位点的双标签序列（ditag），用AE酶切，分离二聚体标签，连接，形成以AE位点为标界的ditag多联体，最后进行克

21、隆测序。通过序列比较，确定ST是否为未知序列。,8.3 差别杂交及减法杂交技术8.3.1 差别杂交法 构建文库后，如无可用探针，也无基因的序列信息，采用差别杂交法（differential hybridization）筛选目的片段，特别适于分离特定组织或特定发育阶段特异表达及诱导表达基因。差别杂交的技术原理十分简单（图）。,8.3.2 减法杂交技术 减法杂交（subtractive hybridization），又叫做差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，通过DNA复性动力学原理富集目的基因，并以此构建减数文库分离克隆目的基因。本质是尽量除去两种样品中共同存在的基因，使目的基因得到有效的富集

22、，以提高敏感性，尤其适于低丰度mRNA的cDNA克隆。l）mRNA减法杂交 从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列,如图。2）基因组DNA减法杂交（图）,制成亲和探针,亲和层析,衔接头,8.4 差别显示法8.4.l mRNA差别显示 mRNA差别显示（mRNA differential display by PCR,DD-PCR)或称差别显示反转录PCR（different

23、ial display reverse transcriptional PCR,DDRT-PCR），由Liang和Pardee(1992)建立的一种分离、鉴定差别表达基因的方法，具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。1)原理和基本程序 在RNA聚合酶的作用下，以mRNA为模板和3锚定引物合成cDNA。在poly（A）5上游的两个碱基只有12种排列组合。因此，可设计合成12种不同的3锚定引物，每种引物都能把mRNA群体的1/12分子反转录成cDNA。,然后，以一种由 10个核苷酸组成的 5随机引物（arbitrary primer，AP）和3锚定引物进行PCR，以扩增获得足够的cDNA进

24、行差别显示。使用12种3锚定引物和24种5随机引物组成的全部288组引物对作PCR扩增，应能得到 20 000条左右的 DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体涵盖在一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部mRNA。在 PCR反应中加入35S或32P以标记反应底物。大约反应 40次循环后，进行变性PEGE，经过放射性自显影可发现，一对引物在凝胶板上可显示60160个条带，条带大小在 100500 bp范围。在同一胶板上进行不同样品间比较，就可显示出差异表达条带。最后将差异条带从胶上切割下来，回收cDNA，利用该片段制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离该差异片

25、段对应的全长cDNA或完整基因(图),32p-dATP,差别显示分析的基本流程,2）DDRT-PCR的优缺点 优点：用样少；操作简易、快速和高效；几乎可检所有表达基因；可同时比较多种细胞类型；可同时展现所有差异；可同时检测基因的上调和下调表达。不足：工作量大，要进行288次PCR；大片段cDNA易丢失；假阳性高（常达5075）；Northern印迹步骤繁杂；本底较高，缺少定量手段，判断差异条带一定难度。8.4.2 代表性差别分析技术(representation difference analysis，RDA）利用PCR具有指数形式扩增双链，线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复

26、杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，到分离未知基因。,1）代表性差别分析技术 通过突变型（driver DNA）与野生型（tester DNA）基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。以野生型DNA为检测DNA，而突变型DNA为驱赶DNA，可获缺失序列；反过来，可获得重排和扩增的基因。主要步骤：DNA的制备：基因组DNA经能识别6碱基的限制酶切，连上含该酶切位点的接头，PCR扩增后用同一内切酶切下接头，再连上另一组含该酶切位点的接头制成检测DNA；异常或正常基因组DNA切下接头后，不再连上另一组接头制成驱赶DNA。液相杂交：检测DNA和驱赶DNA按一定的比例（1:100200），

27、在适当的缓冲体系中高温变性，中温（67）复性（20h）后，出现四种组合DNA片段：检测DNA中仅有的片段自身复性；检测DNA和驱赶DNA复性；驱赶DNA自身复性及检测DNA和驱赶DNA都是单链。,特异片段的富集：用SI核酸酶除去单链DNA，只有检测DNA两端带有接头；将其两端补平后，以原接头为引物进行PCR扩增，扩增产物为检测DNA所特有、而驱赶DNA缺失的DNA片段。以此PCR产物作为检测DNA再次与过量的驱赶DNA杂交，重复三轮杂交后即能充分富集出驱赶DNA中缺失的片段，富集倍数可达106倍。2）cDNA RDA 分别提取总 RNA，合成其双链cDNA。用识别4个碱基的限制酶将cDNA消化

28、成带粘性末端片段。连接上接头并扩增出不同的扩增子。进行与RDA完全相同的消减富集和动力学富集，筛出有意义的cDNA片段。cDNA RDA技术综合了 mRNA DD和 RDA两种技术的特点，因此也具备这两项技术各自的优点，并在一定程度上克服了它们的弊端。,cDNA-RDA,8.4.3 抑制性减法杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)SSH是在RDA的基础上建立的，能有效解决 RDA难以解决的问题，如不能用于分离表达差异较小和上调的基因。1）SSH的原理 核心是抑制性 PCR，将检测子cDNA单链标准化和消减杂交结合为一体。其中标准化步骤均等了检

29、测子中cDNA单链的丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。因此,SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率。抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。,2）SSH的基本过程(如图,P200)制备两种试验材料的mRNA并反转录成cDNA，分别作为检测cDNA和驱赶cDNA

30、。用识别4bp的Rsa I切割成适当的平端片段。将检测cDNA分成均等两份，分别接上接头1或2。接头由一5-端去P的长链（40nt）和一短链（10nt）组成的一端是平端的双链cDNA分子。长链3端与cDNA5端相连。长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。此外，接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后克隆和测序提供便利。第一次差减杂交。用过量的驱赶cDNA分别与上述两份检测cDNA混合，变性后复性杂交，产生4种产物：a单链检测cDNA；b自身复性的同源检测cDNA；c检测cDNA和驱赶cDNA的杂交链；d单链驱赶cDNA。第一次杂交的

31、目的是实现检测单链cDNA的均等化；同时，由于c的形成，可使检测cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。,第二次差减杂交。合并第一次杂交后的两份杂交产物，再与过量变性的驱赶cDNA杂交，此时，只有第一次杂交后经丰度均等化和消减的单链检测cDNA和驱赶cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子（e），它的两个5端分别连上了来自两个样本的不同的接头。第一次PCR反应。在上述产物中加入一对分别与接头1、接头2外侧端21个核苷酸相同的引物作PCR扩增，这时只有两端是不同接头的双链cDNA分子（e）才能呈指数扩增，而两端连上相同接头的同

32、一片段（b）由于末端保留了长反转重复序列，在变性复性过程中形成“锅柄样”结构而不能呈指数扩增。因此，在驱赶cDNA中缺乏但检测cDNA存在的序列，即差异表达cDNA序列得到显著的扩增。,第二次PCR(Nest PCR),见书本P200,第二次PCR反应。选用一对分别与接头内侧端序列相同的引物进行nest PCR，特异性扩增代表了差别表达的cDNA片段。差异片段的初步筛选。经上述PCR所得的代表性差别表达的cDNA片段可以利用接头上存在的酶切位点，插入适当载体，转化细菌。然后测序、序列分析、完整基因克隆、鉴定等。3）SSH的特点 优点：特异性强，假阳性率低,可降至6；敏感性高；速度快，效率高，可

33、同时分离几十成百差异表达基因。不足：要求起始材料较多，微克级mRNA；所得cDNA不是全长cDNA;所研究材料的差异不能太大，且要有良好的遗传背景;实验中进行了两次差减杂交，并且驱赶cDNA都是过量的，可能会导致检测cDNA中某些表达丰度有差别的cDNA被掩盖,可通过调整第一次杂交中供试样品检测cDNA的含量，或在第二次杂交中不加供试样品检测cDNA等方法加以克服。,8.5 DNA插人诱变法（DNA标签法:DNA tagging）主要用于植物基因克隆分离。其基本原理是，当一段已知的DNA序列插入到基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变并形成突变体，或者在插入位置产生一个新的基因。该

34、插入序列可用作探针，从突变体的基因组DNA文库中筛选到突变基因片段。然后再利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。8.5.1 转座子标签法,8.5.2 T-DNA标签法 T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒中的一段特殊序列，当根瘤农杆菌感染植物细胞后，T-DNA便会转移到植物细胞，并通过其两端的25 bp的同向重复序列，随机整合到植物基因组。如果T-DNA整合到一个功能基因内部或其邻近位置，则可能导致该基因失活或产生突变。通过T-DNA上的标记基因（如卡那霉素抗性基因）检测出突变位置，得到与T-DNA相连的DNA片段。再以此DNA片段制备探针筛选野生型基因

35、组DNA文库，就可得到与突变相应的完整基因。因此，T-DNA是高等植物中一种非常有效的分子标签。,8.6 基因定位克隆法 基因定位克隆（positional cloning）又叫作图克隆（map-based cloning）、候选基因克隆（candidate gene cloning），是人类或植物基因的克隆中常用方法，主要根据目的基因在基因组上的位置特性而不是编码产物来克隆基因。基本步骤:定位 确定探针 染色体步移逼近目的基因 克隆目的基因，最后根据测序、定点突变、转基因和基因敲除等方法确定目的基因的功能。必要条件：构建含大片段DNA的基因组文库，如YAC；有可用的与目的基因紧密连锁的DNA

36、分子标记；有生物体基因组高密度RFLP或RAPD分子标记图谱。,8.6.1 染色体步查法（chromosome walking）首先以已知基因作探针筛选到A片段，然后以A片段为探针筛选出B片段，依此类推，最终获得目的基因片段。,8.8 大分子间相互作用克隆法 某些蛋白质分子往往需要与其他蛋白质分子相互作用才能具有生物学效应。因此，利用已知蛋白质分子，能够找出与其相互作用的未知蛋白质分子，并进而克隆其相应的cDNA。8.8.1 酵母双杂交体系 酵母双杂交体系（two-hybrid system），能有效地分离与一已知蛋白质相互作用蛋白的编码基因，广泛用于真核基因的表达与调控、细胞粘合因子间的相互

37、作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究。,8.7 PCR介导法方法（见6 PCR技术及其应用）,l）基本原理：酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的N端1147位氨基酸区段为一DNA结合域（BD），C端768881位氨基酸为一转录激活域（AD）。DNA-BD识别GAL4效应基因的上游激活序列（UAS），并与之结合。而AD则通过同转录必须的其它成份间的结合作用，启动UAS下游的基因转录。通过DNA重组把BD与AD分开，并在同一细胞中表达出BD和 AD多肽，但由于彼此间的空间隔离，不会发生相互作用，故不能激活效应基因转录。若将BD和AD分别与来自能

38、结合的两个蛋白的基因融合，BD和AD 则在体内重新组装成具有功能的转录因子（图），激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达。,诱饵,猎物,2）酵母双杂交体系的寄主菌株及载体 常用的酵母寄主菌株有SFY526和HF7c，它们都丧失了表达内源GAL4转录激活因子的能力，因此适于用来检测外源GAL4转录激活因子的功能活性。质粒载体pGBT9（图），又叫做DNA-BD质粒载体。靶基因是按正确的取向和读码结构被克隆在这个载体的多克隆位点区内，于是便在靶蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成诱饵蛋白质（bait）。质粒载体pGAD424（图），又叫AD质粒载体，它是用来构建cDNA表达文库的专用载体。

39、克隆的cDNA片段是按正确的取向和读码结构插在载体的多克隆位点区内，因此由cDNA编码的蛋白质便会同GAL4-AD之间产生融合作用，形成靶蛋白质（prey）。这两种杂种蛋白质都能够在酵母细胞中得到高水平的表达，而且在核定位序列的作用下进入酵母细胞核。,AtIQM2(Bait),AtCaM5(Prey),3）酵母双杂交体系的实验程序 将已知蛋白质的编码基因插入pGBT9，同时把cDNA片段克隆在pGAD424上,构成cDNA表达文库。提取上述两种质粒，共转化酵母寄主菌株HF7c（具报告基因UAS-promoter-HIS3）。在缺少Leu和Trp的培养基上培养，以便挑选有两种质粒的转化子；同时也

40、在缺少His、Leu和Trp的培养基上培养，以便挑选能表达相互作用的杂合蛋白的阳性菌落，从而克隆到与已知蛋白质相互作用的cDNA。4）酵母双杂合系统分离目的基因的优缺点 优点：操作简单，便捷，高度敏感，不需要制备抗体或纯化蛋白。缺点：限制了不能定向到核内的蛋白在此系统中的应用；难以研究胞外蛋白间的相互作用，如分泌过程中的许多翻译后加工（如N端糖基化、二硫键形成等）；本身就有转录激活活性的蛋白质，会直接激活报道基因，导致假阳性；外源基因的转录、翻译、修饰及转运等在酵母中完成，很难预料由此产生的偏差与错误；外来分子或配体如果以影响酵母细胞的生长、代谢乃至基因的表达调控，那么也会出错。,Zhou a

41、t al.(2010),IQM1 possesses an IQ motif and may be a Ca2+-independent CaMBP,Yeast two hybrid assay on IQM1 and CaM5,BD粒载体,AD载体,UAS,Promotor,LAC Z,Trp,转入报告基因的酵母(无LacZ,Trp缺陷型),IQM1 is able to bind with CaM5 in yeast,Complete medium Trp-medium Trp-medium+X-gal,1：pHYbLex/Zeo2：pHYbLex/Zeo+pYESTrp23：pHYbLe

42、x/Zeo+pYESTrp2-IQM14：pHYbLex/Zeo-CaM5+pYESTrp25：pHYbLex/Zeo-CaM5+pYESTrp2-IQM16：positive control,pHYbLex/Zeo-Fos2+pYESTrp-Jun,8.8.2 双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)在生物体内研究蛋白质之间的相互作用,BiFC assay between IQM1 and CaM2,Vectors for BiFC,Epidermal cells of onion,IQM1 is able to bind

43、with CaM5 in vivo,BiFC:bimolecular florescence complementation,CaM5 presented in plasma membrane proteome(Marmagne et al.,2007),8.8.3 噬菌体展示(phage display)噬菌体展示是一项筛选技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（pa

44、nning）的体外选择程序得以快速鉴定。,E.coli,最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。,Yeast Surface display,Disulphide bond,(a)Schematic representation of surface display.,(b)A vector used for facilitating surface display.HA,haemagglutinin epitope;c-myc,c-myc epitope.,分离和筛选目的基因的主要方法,1 名词解释 SSH、RDA、DDRT-PCR、ESTs、酵母双杂交、cDNA文库、基因组文库2 简要回答问题 1）简述cDNA文库构建的原理与步骤 2）简述基因组文库构建的原理与步骤 3）简述酵母双杂交的原理与步骤3 分析讨论 试述分离和筛选目的基因的主要方法和原理.,复习思考题,