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1、氯霉素类药物在兽医临床上应用及其残留研究进展,于文刚,氯霉素类抗生素的介绍及应用氯霉素的残留标准氯霉素残留检测方法,氯霉素类抗生素的介绍及应用,氯霉素类(Chloramphenicols，简称CAPs)包括氯霉素及其衍生物，又称为酰胺醇类（Amphemicols）。兽医临床应用的主要有氯霉素（Chloramphenicol），甲砜霉素（Thiamphnicol,TAP）、氟甲砜霉素（Florfenicol,FF）,氯霉素类抗生素的化学结构,作用机制,与70s核蛋白体的50s亚基上的A位紧密结合，阻碍了肽酰基转移酶的转肽反应，使肽链不能延伸，而抑制蛋白质的合成。,氯霉素（Chlorampheni
2、col）,理化性质为左旋体，在水中微溶，在弱酸性和中性溶液中较稳定，能耐煮沸，遇碱易失效。为广谱抑菌剂,主要抑制细菌肽链形成,使蛋白合成受阻,高浓度也能杀菌。一般对革兰氏阴性菌的作用比阳性菌强,对厌氧菌也有相当作用,但对绿脓杆菌、结核杆菌、病毒、真菌等无效。,内服易吸收(马、牛、羊例外),肌肉注射吸收缓慢(琥珀氯霉素的水溶性强,吸收也迅速)。体内广泛分布,肝、肾中浓度最高,亦易透过血脑屏障进入脑脊液。在肝内大部分被失活,仅10%原药从尿中排出。用于防治畜禽的沙门氏菌病和大肠杆菌感染。对牛巴氏杆菌病、禽霍乱及敏感菌引起的泌尿道、呼吸道感染也有效。,不良反应：抑制骨髓造血机能可逆性地抑制骨髓(与使
3、用剂量和疗程有关)临床表现为使用剂量或频率依赖性的血细胞减少，一般在停药后12d内恢复正常。不可逆的再生障碍性贫血（与CAP的使用剂量和疗程无关，与个体特异性反应有关）即使与药物停止接触，骨髓抑制仍将长期存在，骨髓造血功能极少恢复。临床表现为全血细胞下降，死亡率高达5070，存活者也容易发生粒细胞性白血病，发生CAP再生障碍性贫血的几率为1：30000，虽然几率不高，却是致命性的。,不良反应由于氯霉素能够抑制记忆性的免疫应答反应，故动物接种疫苗期禁用。氯霉素亦可产生胃肠道反应和四环素类相似的二重感染。氯霉素为肝微粒体药酶的抑制剂，能明显减慢其他药物的代谢，从而延长其他药物的效果，或增强其毒性。
4、,本品是第一个用于临床的广谱抗生素(1949年),因50年代发生致死性再生障碍性贫血和灰婴综合征,80年代又出现耐氯霉素菌株,加上其他广谱抗菌药的陆续出现,使在国内外的应用普遍减少。1984年FDA禁止氯霉素用于所有食品动物。,甲砜霉素thiamphenicol,是氯霉素的同类物,水溶性略大于氯霉素,性更稳定。抗菌谱与抗菌作用近似氯霉素,对多数肠杆菌科细菌、金葡菌及肺炎球菌的作用略逊于氯霉素。与氯霉素可完全交叉耐药。内服吸收迅速而完全,体内广泛分布,在肝内不被失活,组织中含量高于同剂量氯霉素(肾、肺、肝中约高34倍),因而体内抗菌活性也较强。以原型经肾排泄。适应症同氯霉素。在呼吸道、胆汁和尿液
5、中含量高,故主要用于呼吸道、肠道和尿路感染。本品仍有血液系统毒性(可逆性红细胞生成抑制),对免疫也有较强的抑制作用(约比氯霉素强6倍)。但不产生再生性障碍性贫血。,氟苯尼考 Florfenicol,动物专用氯霉素类的广谱抗菌药1990年首次在日本上市，用于水产养殖业1993年挪威批准该药治疗鲑的疖病1995年法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙批准用于治疗牛呼吸系统细菌性疾病。在日本和墨西哥还批准用作猪的饲料添加剂，预防和治疗猪的细菌性疾病.我国目前已通过了该药的审批。,氟苯尼考 Florfenicol,具有抗菌广谱，吸收好，体内分布广，安全高效等特点1.广谱 对革兰氏阳性菌及阴性菌皆有强大的杀
6、灭作用，对厌氧革兰氏阳性菌及阴性菌、立克次氏体、支原体均有较强的抗菌作用。2.速效 口服或肌注1小时后血液中可达治疗浓度。1.53小时即可达药峰浓度；有效血药浓度可维持20小时以上。3.穿透力强，组织药物浓度高，可透过血脑屏障，特别适用于控制脑部和呼吸道感染。,4.毒性小 安全，在规定休药期（28天）停药无残留能保证人，畜安全。5.安全范围大，用推荐剂量的十倍，不会产生不良反应和中毒。6.不易产生耐药性。F原子取代了氯霉素、甲砜霉素中丙烷链3碳位置上的-OH，阻止了细菌乙酰转移酶在此位置上的乙酰化作用。对氯霉素、喹诺酮类及其他抗菌药物耐药的细菌仍敏感。,适应症,动物专用广谱抗生素特别适用于对氯
7、霉素、喹诺酮类及其他抗菌药物有耐药性的细菌感染主用于牛、猪、鸡和鱼类的细菌性病，如牛：呼吸系统疾病、巴氏杆菌病、沙门氏菌病、大肠杆菌病、葡萄球菌感染、链球菌感染、乳房炎(干乳期)、棒状杆菌病等。猪：传染性胸膜病、猪喘气病、沙门氏菌病、大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎，猪丹毒、猪肺疫、无乳综合症等。鸡：大肠杆菌病、沙门氏菌、传染性、慢性呼吸道病及葡萄球菌病等。注：有胚胎毒性，故妊娠动物禁用。,用量：im/iv:20mk/kg 鸡内服：20-30 mk/kg 猪混饲50ppm用法：注射液：畜：每个注射部位不超过10ml，1次/48h，连用2次；禽：1次/日，连用3次。溶液/可溶性粉：饮水给药 预混剂（5
8、00 ppm）：拌料,氯霉素对人的危害,1、骨髓造血机能紊乱:氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少、粒细胞缺乏、再生障碍性贫血、溶血性等，多数在长期或多次用药的过程中发生。发生率约为1/100000-1/5000。骨髓的毒性分为两类：一是可逆性抑制。主要影响红细胞、血小板和白细胞的形成。二是再生障碍性贫血。前者与剂量有关，药物的血浓度超过5ug/ml即可出现；后者少见，发生较晚而极为严重，与氯霉素的每日用量和总量均无直接关系。2、灰婴综合症:在早产儿和新生儿肝内有些酶系统发育尚不完全，葡萄糖醛酸结合的能力较差，因此影响氯霉素在肝中的解毒过程；此外，肾脏排泄能力亦较弱，能招致药物蓄积
9、中毒。3、胃肠道症状、口部症状：胃肠道反应主要有腹胀、腹泻、食欲减退恶心、呕吐则少见。口部症状如口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。4、其它不良反应:可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生中毒性精神病，主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。,氯霉素的残留标准,氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素，虽然是国家规定的食品动物禁用药品，但是由于其具有疗效好、价格低廉等优点，目前仍有小部分人不顾国家规定，将其应用于各类家禽、家畜及水产品的各种传染性疾病的治疗。氯霉素有其严重的副作用，它会抑制人体骨髓的造血功能，从而引起再生障碍
10、性贫血和粒细胞缺乏症。因此，近年来，世界各国特别是欧盟、美国等发达国家对动物性食品中氯霉素残留的检测要求日趋严格，分析方法的检测限不得超过0.1ug/kg,部分国家检验检疫要求,1999年9月13日中华人民共和国农业部发布了动物性食品中兽药最高残留限量的通知，规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出。中国农业部已将氯霉素从2000年版中国兽药典中删除列为禁药。2002年1月，美国食品与药品管理局（FDA）公布了禁止在进口动物源性食品中使用氯霉素 欧盟的进口食品卫生标准规定“氯霉素含量标准为不得检出。”其“不得检出”的含义是氯霉素含量在1ppb以下，即含量在十亿分之一以下。2002 年，
11、欧盟提出氯霉素的最低检测限为0.3g/kg。德国部分州的特殊检测标准为0.2ppb。日本对中国的动物源性食品中氯霉素的检测最高限量为0.05mg/kg。我国方法检测限量值：牛奶 0.25ng/ml 肉类1.5ng/g 尿液1.0ng/ml 血清0.5ng/ml 蜂蜜(快检)1.5ng/g 蜂蜜(18柱)0.1ng/g,U.S.Residue Limits for Veterinary Drugs and Unavoidable Contaminates in Meat,Poultry,and Egg Products,Appendix provides information on the r
12、esidue limits(tolerances and action levels)for animal drugs,food additives,and unavoidable contaminants in meat,poultry,and egg products.The Food Safety and Inspection Service in its regulatory programs apply chemical residue limits,which are set by the Food and Drug Administration(FDA).The official
13、 source of these tolerances is Title 21 of the Code of Federal Regulations(CFR).Those for animal drugs are found in CFR,Title 21,Part 556,those for food additives are found in Title 21,Part 172,Section 172.140,and those for unavoidable contaminants are found in,Title 21 Part 109,Section 109.30.In ad
14、dition,FDA may establish action levels that are published in the Federal Register(FR).FSIS does not permit concentrations of chemical residues in meat,poultry,and egg products to exceed the tolerances or action levels published in the CFR or FR.,Reference:21 CFR 556.20(the Code of Federal Regulation
15、s),Reference:21 CFR 556.283(the Code of Federal Regulations),CONSOLIDATED VERSION of the Annexes I to IV of Council Regulation n2377/90 List of pharmacologically active substances for which maximum residue limits have been fixed).,Florfenicol,Bovine 200 g/kg Muscle 3000 g/kg Liver 300 g/kg KidneyPor
16、cine 300 g/kg Muscle 500 g/kg Skin+fat 2000 g/kg Liver 500 g/kg KidneyChicken 100 g/kg Muscle 200 g/kg Skin+fat 2500 g/kg Liver 750 g/kg Kidney,Not for use in animals from whicheggs are produced for human,Thiamphenicol,Bovine 50 g/kg Muscle 50 g/kg Fat 50 g/kg Liver 50 g/kg Kidney 50 g/kg Milk Chick
17、en 50 g/kg Muscle 50 g/kg Skin+fat 50 g/kg Liver 50 g/kg Kidney,Not for use in animals from whicheggs are produced for human,List of pharmacologically active substances for which no maximum levels can be fixed,Pharmacologically active substance(s)Aristolochia spp.and preparations thereofChlorampheni
18、colChloroform(氯仿）Chlorpromazine（氯丙嗪）Colchicine（秋水仙碱）DapsoneDimetridazole（地美硝唑）Metronidazole（甲硝唑）甲硝唑Nitrofurans(including furazolidone)（呋喃类药物）Ronidazole（洛硝哒唑）,VETERINARY DRUGS DIRECTORATE,Florfenicol Cattle Muscle 0.2 Liver 2.0 Swine Muscle 0.25 Liver 1.4 Salmonids（鲑鱼）Muscle 0.8（The units are in ppm
19、for tissues and ug/ml for milk unless otherwise noted in the table）,氯霉素残留检测方法,对于氯霉素残留，由于存在多种检测方法，因此各种方法的检出限问题已成为关注的焦点。发达国家对检出限的要求越来越严格。欧盟由原来的10g/kg改为1g/kg，继而又降至0.1g/kg，比原标准要求提高了100倍；美国FDA规定的检出限也由原来的5g/kg降为0.3g/kg，且目前正在研究应用更为灵敏的方法，可使检出限值达0.1g/kg。,氯霉素残留的检测方法,氯霉素在动物性食品中残留分析方法的研究始于20世纪80年代，至今已建立起许多方法，主要
20、以微生物学、免疫学的方法作为筛选法，液相色谱法（Liquid Chromatographic Method,LC)和气相色谱法(Gas Chromatographic Method,GC)进行定量测定,液相色谱/质谱联用分析法(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Method,LC/MS)或气相色谱/质谱联用分析法(Gas Chromatography/Mass Spectrometry Method,GC/MS)进行确证。,筛选法,主要包括以氯霉素抑菌作用为基础的微生物学法，以氯霉素抗原抗体特异性免疫反应为基础的免疫学法，以氯霉素衍生偶合反应为基础
21、的化学显色法，薄层色谱法等（Thin Layer Chromatographic Method,TLC)其中微生物学法和免疫学法较为常用。,微生物学法,微生物学法的原理是利用特定菌株与药物的作用来检测样品中CAP的种类和含量。常用方法有棉签法(Swab Test On Premises，STOP)和杯碟法(Cylinder Plate Method，CPM)。,STOP 用棉签蘸取动物组织液，置于涂满枯草杆菌的培养基中保存过夜，以棉签周围是否出现抑菌环及其直径大小来判断结果，STOP以前在美国、加拿大等国家肉类兽药残留筛选中广泛应用，检出限为1mgkg，优点是设备简单，操作简便，缺点是特异性差
22、，灵敏度低。CPM 是将处理后的样品注入牛津杯，与含菌液的检测平板贴合，培养后根据抑菌圈直径的大小来判定结果，CPM 的检出限为0.12mgkg，比STOP灵敏度高，并可在样品的处理中加入其他抗生素以消除干扰影响。微生物学法简便，费用低，但敏感性和专一性低，易漏检，也会出现假阳性，引起误判，但对于高残留样品进行残留筛选仍不失为一种好的方法。,免疫分析法,氯霉素免疫测定法包括放射免疫测定法（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA)。RIA 的基本原理是用同位素标记药物样品，和非标记待测药物与CAP抗体结合竞争，样品中的被测物含量与测定的放射性活度成反比，常用的标记物是同位素H、C、I等，RIA
23、的优点在于灵敏、特异、简便，但标记物易衰变，影响了其准确性。,ELISA是基于抗原和抗体反应而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激机体产生抗体。要使半抗原性物质具有免疫原性，就需使其与大分子载体物质（蛋白质）相结合制备人工抗原，而后将其作为抗原进行使用，动物体内即可产生相应特异性的抗氯霉素的抗体。在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量。ELISA避免了RIA存在的稳定性问题，更加简便、灵敏，检测限达到pg级，且同时可检测多数样品，是十分理想的快速筛选手段，缺点在于出现假阳性的概率较大，易引起误判。,因ELISA 具有快速、灵敏度高、专一性强的优势，在肉制品、水产品与环境中应用相当广泛。目前
24、国内、外研制的氯霉素ELISA 检测试剂盒，广泛用于氯霉素的检测。如Randox公司提供的氯霉素检测试剂盒对组织中氯霉素的检测限可达0.02ng/kg，尿液中氯霉素的检测限可达0.01ng/kg，回收率为84%以下，且与四环素、庆大霉素，氨苄青霉素无交叉反应，检测时间不到1.5 小时,定量测定法,目前国际公认的氯霉素的定量测定方法是气相色谱法(GC)和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC),气相色谱法,GC是1974年在美国官方分析化学家协会（AOAC）年会上提出的，原理是氯霉素均含有电子亲和性强的化学基团，可用电子俘获检测器进
25、行测定。GC 是定量测定氯霉素残留较为经典成熟的方法，专一性强，灵敏可靠，检测限低（小于1ug/kg),但由于受到氯霉素挥发性和热稳定性的限制,需要衍生化程序,比较繁琐,一定程度上限制了GC 的应用。,高效液相色谱法,原理：氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素都有很强的紫外吸收，因此可直接用HPLC/UVD 测定。样品制备不需要衍生化过程，操作简单，但UVD选择性较差，具有紫外吸收的杂质都会产生干扰，因此HPLCUVD的检测限比GC高，一般在5ugkg，样品前处理必须排除具有紫外吸收的内源性杂质的干扰。,确证法,气质联用法 GCMS用于动物性食品中CAP的残留确证已是较为成熟的方法，其原理是CAPs硅
26、烷化后都有几个丰度较大的电子轰击碎片离子，便于进行定性鉴别，灵敏度高，在ng级以下。气相色谱选择性离子监测质谱性(GCSIMNS)分析CAP残留，灵敏度更高，可达到pg,液质联用法 LCMS是一种新的确证方法，不需要衍生化处理，操作简便，灵敏度高。LCSIMMS的分析方法，回收率高，检测限低，达到2ngg以下，有很强的检测和确证能力，目前作为理想的残留确证方法已进入实际应用阶。,酶免疫测定法非常适合对氯霉素残留筛选的需要，它能在短短的几个小时检测几十到上百个试样，也不需要复杂的仪器设备，并有特异性强、灵敏度高、试样预处理简单等优点，它在现场监控和基层实际检测上有着广阔的应用前景。而高效液相色谱法和气相色谱法具有精确可靠、灵敏度高、重复性好以及假阳性少等优点，只要选择出简单的前处理条件和色谱条件。在氯霉素残留确认工作中，GC/MS 和LC/MS/MS 是首选的方法。食品中氯霉素残留的检测方法，今后仍采取ELISA试剂盒对样品进行初筛，对阳性或样品用GC/MS 或LC/MS 进行确证。一般来讲，LC/MS 技术确证氯霉素比G C/M S 技术确证迅速，但由于GC/MS 技术的灵敏度高，可利用的碎片离子多，所以目前确证牛奶中氯霉素类残留主要用G C/M S 技术。,
