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1、青霉素及其发酵生产工艺,青霉素简介 发现 化学结构 理化性质 抗菌作用和临床应用青霉素发酵生产工艺 菌种 发酵工艺流程 培养基 发酵培养控制 提取精制,青霉素的发现,1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培养葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后得到的菌株鉴定为青霉，并将这菌产生的抗生物质命名为青霉素。,1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有卓越疗效。,青霉素类抗生素,青霉素(Penicillin)又称盘尼西林，是人类发现的第一种
2、抗生素，也是目前全球销量最大的抗生素。青霉素是-内酰胺类抗生素中的一类，是分子中含有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞的系列生长期起杀菌作用的一类抗生素。一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。,青霉素的化学结构,青霉素是-内酰胺类抗生素中的一类，具有-内酰胺环结构；是分子中含有青霉素母核（青霉烷）的多种化合物的总称。,分子结构球棍模型,-内酰胺环,6-氨基青霉烷酸,青霉素类抗生素,青霉素G 青霉素X 青霉素V,霉菌属的青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有多种G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、产量最高。,青霉素N 青
3、霉素K,青霉素理化性质,一元有机酸,一般的羧酸 Pka 4-6PG Pka 2.7（解离常数）,不稳定性,内酰胺环是青霉素中最不稳定的部分，原因：1、四元环和五元环稠合，环的张力大 2、两个环不在同一平面，青霉素结构中-内酰胺环中羰基和氮原子的孤对电子不能共轭，易受到亲核性或亲电性试剂的进攻，使-内酰胺环破裂。,-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、醇、胺不稳定，-环开裂、活性降低或消失,对碱或酶(-内酰胺酶)不稳定，水解,对稀酸不稳定，发生重排；,对强酸不稳定，发生重排,青霉素的理化性质,青霉素本身为一元有机酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。青霉素游离酸易溶于醇、酸、醚、酯等一般有机
4、溶剂，但在碳氢化合物中溶解度很小；在水中溶解度也很小，且会迅速丧失抗菌能力。青霉素金属盐类极易溶于水；几乎不溶于乙醚、氯仿、醋酸戊酯，略溶于乙醇、丁醇、酮类和醋酸乙酯。青霉素钠盐、铵盐、钾盐吸湿性依次减小，钠盐比钾盐更不易保存。青霉素游离酸不耐热，一般保存于冰箱中；但青霉素盐的结晶纯品，稳定性很好，在干燥条件下可于室温保存数年。青霉素钾盐结晶，150 加热1.5h效价无影响，因此结晶青霉素可干热灭菌。青霉素临床上一般用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。粉针剂，有效期2年 临床用粉针剂，现用现配,抗菌作用和临床应用,青霉素主要抑制革兰氏阳性细菌，但对某些革兰氏阴性细菌，螺旋体及放线菌也有较强
5、的抗菌作用。青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。,青霉素的应用,溶血性链球菌感染。肺炎链球菌感染。不产青霉素酶葡萄球菌感染。炭疽。破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感钩端螺旋体病。流行性脑脊髓膜炎。放线菌病。淋病。除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染。青霉素与氨基糖苷灯药物联合用于治疗草绿色链球菌心内膜炎。,青霉素发酵生产工艺,青霉素制备的一般流程图,菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理及种子加滤提取及精制成品检验成品包装,前体,发酵阶段,提取精制,菌种,目前国内青霉素生
6、产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉素。,菌种,青霉素最初生产菌为音符型青霉菌，生产能力仅为几十个单位，不能满足工业生产需要。后来发现适合深层培养的新菌种产黄青霉，生产能力100U/ml，经不断诱变选育，目前平均生产能力66000-70000U/ml，国际最高生产能力已超100000U/ml。,青霉素产生菌的生长过程,分生孢子发芽期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒减少，小空孢大空孢自溶,菌丝生长期,青霉素分泌期,菌丝自溶期,14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。45期为生产期，生产能力
7、最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。,青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。,菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，PH上升。,丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，
8、孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h）一级种子培养液（27C，种子培养，24h）二级种子培养液（2726C,发酵,7天）发酵液。,青霉素发酵过程,青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。,青霉素的发酵,发酵工艺控制：1.基质浓
9、度 2.培养基成分的控制 3.温度 4.pH 值、溶氧 5.菌丝状态 6.泡沫的控制,发酵工艺控制,1.基质浓度：在发酵过程中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制,苯乙酸的生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成。所以，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，以维持一定的最适浓度。,发酵工艺控制,2.培养基成分的控制:A.碳源：发酵中常用乳酸或葡萄糖。乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体
10、或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加，以降低成本。,发酵工艺控制,B.氮源：主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因而利用率较高。有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。,发酵工艺控制,C.无机盐：碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值 为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制
11、发酵液中铁含量在30ug/mL以下。现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液；发酵时间愈长，则铁离子愈多。铁离子在50g/ml以上便会影响青霉素的合成。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。,发酵工艺控制,D.前体：前体的加入是青霉素发酵的关键问题之一。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度。但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。也有采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。前体要在发酵开始20h后加入，并在整个
12、发酵过程中控制在50g/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。,发酵工艺控制,3.温度：青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别,但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗,降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说,最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素的合成。,发酵工艺控制,4.pH 值、溶氧：pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为在6.87.2 左右,应尽
13、量避免 pH 值超过7.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。,5.菌丝状态：菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下，当
14、比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比。因此,要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低0.015h-1。菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度,并避免结球,是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。,发酵工艺控制,6.泡沫的控制：在发酵过程中产生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡。应当控制其用量并要少量多次加入,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌
15、体的呼吸代谢。加消沫剂控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。,染 菌 处 理,染菌是发酵工业长期以来不能彻底解决的问题，因此如何解决染菌问题就成了发酵工业的工作重点之一。要解决染菌问题首要问题就是要能检测出是否染菌。染菌通常通过三个途径发现：无菌试验，发酵液直接镜检，发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。,染 菌 的 处 理,染菌在发酵过程的每个阶段都可能发生，下面就各个不同的阶段的染菌情况和处理办法一一说明。种子培养期染菌 发酵前期染菌 发酵中期染菌 发酵后期染菌,染 菌 的 处 理,种子培养期染菌 种子培养主要是生长繁殖菌体。此时菌体浓度低，培养基营养丰富，因此容易
16、染菌。种子培养期染菌，带进发酵罐中的危害极大，应严格控制种子污染。当发现种子受污染后均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。,返 回,染 菌 的 处 理,发酵前期染菌 发酵前朗主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成很少，染菌后杂菌容易繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成，因此要特别注意发酵前期的染菌。当发酵前期染菌时，由于营养成分消耗不多，能耗也不大，从经济性的角度考虑应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种进行发酵。,返 回,染 菌 的 处 理,发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。如产酸，产泡沫，使菌体自溶，使发酵液变
17、臭等。发酵中期染菌，由于营养成分大量消耗，一般挽救处理困难，危害性大，发酵中期染菌应做到早发现，早处理，通常做法是“倒罐”，即用一罐没有染菌的发酵液与染菌的发酵液混合，使有害菌浓度下降，生产菌浓度提高进而重新成为优势生长菌群。显然，倒罐必然造成物料消耗和操作费用的增加。,返 回,染 菌 的 处 理,发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多，效价已经很高，营养物质接近耗尽，此时如染菌量不多，可继续进行发酵，如严重污染也可提前放罐，停止发酵，这在经济上往往是合算的。,下游操作,过滤萃取脱色结晶,发酵液预处理,青霉菌素发酵后，放罐，加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤（青霉菌丝较粗，过滤较容
18、易），除掉菌丝体及部分蛋白，过滤收率一般在90%左右。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷却至10 低温保存，备后续提取精制。,通常发酵液中青霉素浓度很低，仅0.1%4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍。发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物等。,提 取,溶媒萃取法 青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。常用有机溶剂：醋酸丁酯（或戊酯）,提 取,溶媒萃取法 萃取2-3次。从发酵液萃取到醋酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从醋酸丁酯反萃到水相
19、时，pH选择6.8-7.4。发酵滤液与醋酸丁酯体积比3-4。萃取总收率在85%左右。,青 霉 素 提 取,青霉素的提取遵循下面四个原则：时间短 温度低 pH适中 勤清洗消毒,脱色,萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。,结晶,萃取液一般通过结晶提纯。直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液，得到青霉素钾盐。共沸蒸馏结晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇，1626，0.67-1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素钠产品。,青霉素钾盐发酵生产流程,谢谢！,
