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1、黑水银莲花生物活性、化学成分初探及其与多被银莲花的比较研究,姓 名：王艳梅指导教师：张连学 教授,研究目的和意义,银莲花属植物药用历史悠久，主要具有抗风湿功效。该属植物东北地区有13种，其中黑水银莲花(Anemone amurensis(Korsh.)Kom)为本区特有植物。多被银莲花用于治疗风寒湿痹，骨节疼痛，臃肿金疮及静脉炎等症，是活络丹和再造丸的主要原料；黑水银莲花只在记载中有发汗，增强肝肾功能的作用，但并无药理学及临床应用报道。经资源调查，在长白山区黑水银莲花资源量丰富，且经常与多被银莲花（两头尖）混生在一起。本研究从黑水银莲花和多被银莲花的色谱学及化学成分含量的比较研究入手，获知二者
2、的成分上的差异，进而对黑水银莲花各提取部位进行活性试验及成分分析，同时对黑水银莲花的植物形态、显微结构、生境及遗传性状进行研究，以期为开发应用黑水银莲花这一长白山野生植物资源提供科学依据。,提 纲,一.银莲花属药用植物研究进展,1.银莲花属植物的分类学研究 2.银莲花属植物的主要药理作用 3.银莲花属植物的化学成分,银莲花属植物的分类学研究,银莲花属植物的分组 组1.西南银莲花组组2.鹅掌草组组3.草玉梅组组4.卵叶银莲花组组5.打破碗花花组6.钝裂银莲花组组7.银莲花组组8.二歧银莲花组,孢粉学研究 1.三沟花粉类型2.多沟花粉类型(多为6-8沟)3.散沟花粉类型4.散孔花粉类型5.散沟具刺
3、状雕纹花粉类型6.螺纹状萌发孔花粉类型,银莲花属植物的主要药理作用,1.抗癌作用 2.抗炎作用 3.镇痛作用 4.解热作用 5.镇静作用 6.抗惊厥、抗组织胺作用7.免疫调节作用,8.抗氧化作用 9.抑菌作用 10.杀虫作用 11.CAMP-PDE抑制活性12.毒性作用 13.溶血作用,银莲花属植物的化学成分,三萜及其苷类 香豆素类 黄酮类 有机酸类 酯类,氨基酸挥发油 油脂 微量元素其它成分,黑水银莲花和多被银莲花的比较研究,TLC色谱比较,薄层色谱研究方法和条件的建立,吸附剂的选择：硅胶G,展开剂的选择和确定：石油醚层-苯甲醇=41；乙酸乙酯层-乙酸乙酯乙酸水=831；正丁醇层-氯仿乙酸乙
4、酯甲醇水=15402410,显色剂：10%硫酸乙醇,展开方式：上行法；1020cm的硅胶G板,黑水银莲花和多被银莲花各层图谱,石油醚层荧光和显色后各点颜色及其位置,乙酸乙酯层荧光和显色后各点颜色及其位置,正丁醇层荧光和显色后各点颜色及其位置,TLC 讨论,通过对黑水银莲花和多被银莲花不同提取部位薄层色谱的系统研究比较可知：黑水银莲花和多被银莲花的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇层的薄层色谱在斑点的颜色、大小、多少等方面均有明显的区别。,黑水银莲花与多被银莲花HPLC图谱比较,仪器：Agilent 1100 高效液相色谱仪，DAD二极 管阵列检测器色谱柱：Diamonsil(TM)C18(250mm4.
5、6mm，5m)柱。柱温：30 进样量：20l 流动相：A乙腈 B 0.4%磷酸水溶液，不同溶 液梯度洗脱条件不同。检测波长：203nm,HPLC图谱比较,黑水 95%乙醇HPLC谱图,多被 95%乙醇HPLC谱图,1.95%乙醇提取HPLC谱图比较,梯度洗脱表,2.乙酸乙酯提取物HPLC谱图比较,黑水 乙酸乙酯HPLC谱图,多被 乙酸乙酯HPLC谱图,梯度洗脱表,3.正丁醇提取HPLC谱图比较,黑水-正丁醇HPLC谱图,多被-正丁醇HPLC谱图,梯度洗脱表,HPLC结果,由3种不同极性提取液HPLC图谱表明，两种银莲花中所含物质成分上稍有不同，含量上有显著差异：成分上，95%乙醇提取多被银莲花
6、HPLC图谱在2530min是有明显两个峰出现，而黑水银莲花没有，其他出峰时间几乎相同，证明两种银莲花成分上很相似。含量上，3种溶剂提取的同一出峰时间的峰面积、峰高均不相同，有的差异很大，证明两种银莲花在相同成分上含量不同。,结果,N=5,总糖及还原糖的分析测定,通过精密度、稳定性及回收率实验证明选用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定银莲花糖类物质具有方法简单、易行，重复性良好，灵敏度高，显色稳定等优点。,讨论,实验结果显示多被银莲花总糖和还原糖的含量都高于黑水银莲花，其中总糖高出1.69%，还原糖高出4.81%；而黑水银莲花的粗淀粉含量高于多被银莲花3.13%。,多糖的测定分析,粗多糖
7、提取工艺的优化,多糖的精制及含量测定,结果与分析,单因素试验,正交试验,粗多糖,脱蛋白,换算因子,蒽酮硫酸法,原料乙醇 回流,单因素实验,料液比对多糖提取率影响,提取时间对多糖提取率的影响,最优提取条件为：温度80，料液比1:20，提取时间15h，乙醇浓度90%。,正交试验,粗多糖的精制及含量测定,精制：取0.8%木瓜蛋白酶与粗多糖溶液混合，于4低温过夜，再将混合液于70的恒温振荡器中震荡30min,使蛋白失活，冷却至室温后用Sevag法再次进行脱蛋白，将水层于5000r/min进行离心，收集上清液，浓缩干燥后，再经无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，即得黑水银莲花精制多糖。,换算因子：f=W/(CD
8、),W为多糖质量（mg），C为多糖溶液中葡萄糖的质量（mg）,D为多糖的稀释倍数。,多糖含量（%）：(CDf)/W100,C为供试样品中葡萄糖的浓度（mg/ml），D为供试液的稀释倍数，f为换算因子，W为供试样品的质量（mg）。,讨论（1）,较好的提取工艺条件是:提取温度为80、料液比l:20、提取时间为15h、乙醇沉淀浓度为90%。由于料液比l:15和1:20两水平的提取率相差很小，因此宜选择料液比为1:15。用乙醇沉淀多糖时，乙醇浓度大虽然沉淀多糖较多，但同时杂质也相应增加，给后续精制工作造成困难，故宜选择80%乙醇沉淀多糖。综合考虑多糖性质，提取效率，节约能耗，节省成本等因素，因此最后选
9、择最佳提取工艺条件为提取温度80、料液比1:15、提取时间15h、乙醇浓度80%。选择此工艺条件进行试验，多糖提取率为7.57%，且提取出的多糖色素含量较少，用乙醇沉淀后多糖易复溶。,80%乙醇回流不仅能够除去了大部分皂苷类，利于多糖提取液在后期的减压浓缩（皂苷含量高减压浓缩时易产生泡沫），而且同时还能够消除一部分单糖、寡糖等小分子物质和生物碱类等干扰成分，有利于多糖的提取和纯化。,讨论（2）,本试验测得黑水银莲花中多糖含量较为丰富，为推动其资源的深度开发利用提供了理论依据。多糖具有多种生物活性，能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，对正常细胞没有毒副作用，用多糖研制抗肿瘤、抗病毒、降血糖类药物，
10、已成为当今世界新药发展的新方向之一。,通过单糖与多糖的换算因子，建立了用蒽酮-硫酸试剂显色，分光光度法来测定黑水银莲花中多糖含量的方法，该方法具有稳定、快速、简便等特点。在多糖的含量测定中，因为多糖组成复杂而难以得到相应的多糖对照品，所以多采用葡萄糖代替对照品，但这只能测得样品中多糖的相对含量，样品中多糖的准确含量必须通过单糖和多糖之间的换算因子来计算获得。,氨基酸含量测定,粉末于水解管,0.1%巯基乙醇1ml,6mol/l盐酸 10ml,真空封管后，110恒温水解24h,水解液定容到50ml。,吸取水解液1.00ml，反复蒸干3次。,0.02mol/lHCL溶解，过膜,上机测定,测定结果,结
11、论分析,黑水银莲花中和多被银莲花都含有17种氨基酸。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸含量较高。谷氨酸可促进人体内消化液的分泌，具有预防贫血和解毒作用；精氨酸可控制体内细胞的退化；苏氨酸在人体内有转变氨基酸达到平衡的作用。正确地利用这些氨基酸成分及特性，是充分发挥黑水银莲花利用价值的重要因素之一。,黑水银莲花中含有17种氨基酸。其中7种人体必须氨基酸，总量为2.5238 mg/100mg，占总量的32.9%；多被银莲花7种人体必须氨基酸总量为1.67 mg/100mg，占总量的22.3%。试验可知黑水银莲花的氨基酸含量高于多被银莲花，是否黑水银莲花在药用方面也会又着重要作用呢，有待进一步研究
12、。,微量元素的测定,样品,硝酸-高氯酸（41）20ml,程序消化,微波消解罐,测定结果,结论分析,微波消解技术近年来得到很大发展，具有节省溶剂，空白低，可防止易挥发组分的损失等优点。本试验建立了微波高压消解AAS法测定黑水银莲花中微量元素的方法，具有准确度高，选择性好等优点，是测定植物中微量元素的可靠方法。,黑水银莲花中只有Cu的含量略低于多被银莲花，其余7种元素的含量都远高于多被银莲花。这两种银莲花中K、Ca、Mg、Fe、Na的含量非常丰富。,总黄酮的测定,样品粉末,70%乙醇索式提取，90，3h,30%乙醇定容100ml,取1ml，置于25ml容量瓶加30%乙醇至12.5ml,先加5%亚硝
13、酸钠溶液0.75 ml,再加10%硝酸铝溶液0.75ml,最后加1mol/L氢氧化钠溶液10ml,30%乙醇定容至25ml混匀,放置15min，待测,测定结果,结论,本实验通过铝盐显色可见分光光度计法对黑水银莲花和多被银莲花的总黄酮含量进行分析测定，结果显示多被银莲花中总黄酮含量明显高于黑水银莲花，为二者在含量上的区分提供了理论依据。本实验方法可以作为银莲花属植物中黄酮类化合物含量的快速测定的定量方法。,黑水银莲花不同提取 部位活性试验,酪氨酸酶抑制性试验研究,样品不同提取部位,抗肿瘤活性的试验研究,抗炎活性的试验研究,抗肿瘤活性的试验研究,MTT 法简介,MTT比色法(四甲基偶氮唑盐微量酶反
14、应比色法)，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法灵敏度高、经济实用、操作简单，已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。,将冻存于液氮中的H22/MFC细胞复苏，接种于昆明小鼠腹腔后第八天取腹水用于细胞培养。细胞在37，5%CO2条
15、件下，培养于含10%新生牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml的DMEM培养基中。K562细胞：将冻存于液氮中的K562细胞复苏，培养于含10%新生牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml的的DMEM培养基中。待细胞处于对数生长期时用于MTT实验。,试验方法,当细胞处于对数生长期且状态良好时，进行无血清培养24h。收集肿瘤细胞以1105/ml细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔190l。加入药物使各组终浓度为0.5g/L、5g/L、25g/L、50g/L、100g/L、200g/L，同时设空白对照组和溶媒对照组。37，5%CO2培养箱中培养48h后，每孔加入MTT20l
16、作用4h，加入二甲基亚砜150l，终止反应，轻轻震荡10min使MTT充分溶解，在酶标仪上以试验波长570nm，参考波长630nm测出每孔光密度(OD)值，数据进行t-test检验。因为药物本身有颜色，容易影响给药组的OD值，因此设药物对照组计算细胞生长抑制率：抑制率=对照组OD值-(试验组OD值-药物对照组OD值）/对照组OD值100%,结果（1）,乙酸乙酯层对三种细胞的抑制情况,结果（2）,正丁醇层对三种细胞的抑制情况,结果（3）,水层对三种细胞的抑制情况,讨论1,溶酶对照组与空白对照组相比无统计学差异，表明溶酶浓度下的酒精（0.15%）对细胞生长无影响，符合实验要求,溶酶对照,空白对照,
17、讨论 2,乙酸乙酯、正丁醇层药液对H22、MFC、K562肿瘤细胞的增殖都具有显著的抑制作用，且有显著的时间及浓度依赖性，中剂量组（25g/L）时已达到最高抑制率（85%）,中、高剂量组形成平台期。,乙酸乙酯低剂量,乙酸乙酯中剂量,乙酸乙酯高剂量,讨论 2,正丁醇低剂量组,正丁醇中剂量组,正丁醇高剂量组,乙酸乙酯层的抗癌活性要大于正丁醇层和水层，可推断，黑水银莲花中极性小的部分抑制癌细胞增殖的作用强。,水层药液对MFC细胞24h各剂量组与空白对照组相比无统计学差异，给药48h时中、高剂量组均显示出显著抑瘤作用。而对H22、K562肿瘤细胞的生长无影响（P0.05）。,目的,酪氨酸酶在黑素生成过
18、程中起着极为关键的作用,用药物调节酪氨酸酶的活性,能医治相关的皮肤病,抑制酪氨酸酶活性可能是增白中药的作用机制之一。本实验以黑水银莲花乙醇总提取物及乙酸乙酯，正丁醇层及水层三个不同提取部位为研究对象，进行酪氨酸酶抑制性试验，为黑水银莲花是否具有美白的药理活性提供科学依据。,酪氨酸酶的抑制率(%)=1-(T1-T2)/(C1-C2)100。,T1-T2 是有抑制条件下反应液OD值的改变,T2 是本底。,C1-C2 是没有抑制条件下的反应液OD值的改变,C2 是本底,测定结果,结论,抑制率从大到小依次为乙醇总提物正丁醇层水层乙酸乙酯层。因为乙酸乙酯、正丁醇及水层均为从乙醇总提取物中萃取得到，所以乙
19、醇总提取物抑制率应该最大，符合试验结果。其它三层相比，正丁醇层抑制率最高，说明黑水银莲花中抑制酪氨酸酶的主要化学成分应为皂苷类，也为接下来黑水银莲花的成分分析提出了又一个研究方向。,抗炎活性的试验,计算小鼠耳肿胀度，并作t检验。肿胀度=左耳重右耳重,测定指标,结果,XSD,n=10 P0.05,由实验结果可以看出，黑水银莲花的各部分提取物除正丁醇层及水层外，其他各层皆无明显的抗炎活性，正丁醇层及水层部分与空白对照组相比有显著的抗炎活性，且剂量加大效果显著。所以有必要对正丁醇层及水层部分进一步分离筛选，以期找到抗炎活性成分，合理开发利用黑水银莲花药用资源。,讨,论,黑水银莲花化学成分研究,单体化
20、合物成分提取分离,样品粉末,浸膏,70%乙醇回流提取3次，每次3小时，减压浓缩,悬浮于适量的水中，分批以石油醚，乙酸乙酯萃取,石油醚层,乙酸乙酯层,SiO2柱，PE-Acetone，CHCL3-Actone,SiO2柱 CHCL3-Actone,CHCL3-MeOH,C18H22O2 亚油酸,桦皮酸,薯蓣皂苷元,齐墩果酸,B-谷甾醇,脂肪油的研究,提取,样品粉末，装入圆底烧瓶中，加入石油醚，浸泡24小时，超声10min，于水浴上回流提取1小时，过滤石油醚液层，重复三次，合并石油醚提取液，回收溶剂，得棕黄色半流动的油脂,GC条件,色谱柱：Agilent6890/5973N 填料：HP-5.5%，
21、柱流速：1ml/min。柱温：恒温60，3min。程序升温：10/min，升至240，保持15min。苯基-95%甲基聚硅氧烷，载气高纯氦气。气化温度为：260。MS条件：EI离子源，电离电压70eV，质量范围29-5OOamu。分流比：70:1。溶剂延迟：O。全波长扫描，离子源温度230，扫描周期1s，倍增管电压1200V，进样量0.4l。,结果1,结果2,结论,1,2,3,实验分离的化合物占脂肪油总量的91.3%，鉴定的化合物占总数的87.50%.,长白上临江地区产黑水银莲花脂肪油成分中主要为脂肪酸及其酯占73.5%(不饱和脂肪酸占29.11%，酸酯17.5%，饱和脂肪酸占22.68%，烯
22、酯占4.21%)，醇为1.34%，烷为3.95%，其它为0.42%。,亚油酸相对含量高达29.11%，其次为软脂酸19.2%，软脂酸甲酯3.25%，硬脂酸1.98%。软脂酸具有降血脂、抗动脉粥样硬化，抗血小板聚集及血栓形成的作用;油酸具有降血脂作用和促进饱和脂肪酸及由其所衍生的脂类、胆甾醇等在血液中运行，以减少沉积在血管壁上的可能性，从而达到防止动脉硬化的目的。,黑水银莲花的生药学研究,黑水银莲花原植物,植物株高20-25厘米。根状茎横走，细长，粗约2毫米，节间长约3毫米。基生叶12，或不存在，有长柄；叶片三角形，宽2.55厘米，三全裂，全裂片有细柄，中全裂片又三全裂；叶柄长约9.5厘米。花葶
23、无毛；苞片3，有柄，叶片卵形或五角形，长2.73厘米，宽2.63.8厘米，三全裂，中全裂片有短柄，卵状菱形，近羽状深裂，边缘有不规则锯齿，两面近无毛，柄长1.31.5厘米，扁，边缘有狭翅；花梗1，长1.54厘米，有短柔毛；萼片67，（10），白色，长圆形或倒卵状长圆形，长1.31.5厘米，宽4.45.5厘米，顶端圆形，无毛；雄蕊长46毫米，花药椭圆形，长约1毫米，花丝丝形；心皮约12，子房被柔毛，花柱长约为子房之半，上部向外弯。五月开花。,根茎粉末,根茎横切面,根茎性状,地理位置坡向：北坡偏西40。海拔：840-870m经纬度：N41。58.897;E120。47.153,灌木：卫矛 藤本：狗
24、枣猕猴桃,木本：风桦，白桦，青楷槭，假色槭，白牛槭，色木槭，蒙古栎，大青杨，水曲柳，红松，胡桃楸等，,草本：阴地银莲花，多被银莲花，金腰子，猪牙花（山芋头），小毛茛，朝鲜顶冰花，三花顶冰花，顶冰花，轮叶百合，老丫瓣，歪头菜，美汉草，宽叶苔草，鹿药，汉城细辛，二叶舞鹤草，百花碎米荠，东北延胡索，全叶延胡索，齿裂延胡索，兔葵，荷青花，北重楼。,生境调查,遗传性状,性状遗传参数,：P0.05=0.3809；：P0.01=0.4869,主要性状间的相关系数,结论,1,2,黑水银莲花7个性状的变异系数大小顺序为：叶片数地下重地上重根茎长根茎粗株高茎粗，以叶片数、地下重、地上重、根茎长、根茎粗5个性状变异系数大，变异系数为24.19%46.29%，这些性状在群体中个体差异大。,从试验结果看出黑水银莲花的主要性状地下重与茎粗、根茎长、根茎粗、地上重4性状相关紧密，相关系数为0.39300.7437，相关均到达极显著和显著水平，说明黑水银莲花的根茎产量与植株的茎粗、根茎长、根茎粗、地上重有着密切的关系。,谢谢敬请各位专家批评指正,
