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1、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphateisomerase,TPl)试剂盒说明书微量法IOoT6S注意X正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义:植物叶绿体中磷酸丙糖异构醉是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。测定原理:磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。自备实验用品及仪器:天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫
2、外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制:提取液一:液体IoOmLXl瓶,4保存。提取液二:液体IoOmLX1瓶,4保存。试剂一:液体12mLl瓶,4C保存。试剂二:粉剂Xl瓶,-2(C避光保存。临用前加2mL蒸储水充分溶解;用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融。试剂三:粉剂Xl瓶,-20C避光保存。临用前加2mL蒸储水充分溶解;用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融。试剂四:粉剂Xl瓶,-2Oc避光保存。临用前加2mL蒸饱水充分溶解:用不完的试剂分装后-20保存,禁止反复冻融。酶液提取总TPl酶提取:建议称取约Olg样本,加入ImL提取液一,冰浴匀浆后超声
3、破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间Imin),然后4*C,800Og离心IOmin,取上清测定。胞浆和叶绿体TPl酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为L510的比例(建议称取约0lg样本,加入ImL提取液一),冰浴匀浆后于46,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4C,80C)Og离心IOmin,取上清用于测定胞浆TPl酶活性,取沉淀加ImL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3$,间歇7s,总时间ImirI),然后4C,800Og离心Iomin,取上清测定叶绿体中TPl酶活性。建议测定总TPl酶活性,按照步骤提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿
4、体中的TPI,则按照步骤提取粗酶液。测定操作I1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至340nm,蒸馆水调零。2.取微量石英比色皿出6孔板,依次加入120L试剂一,20l试剂二,20HL试剂三,20L试剂四,20L3.粗醉液,充分混匀,记录34Onm处IoS的吸光值Al和3103的吸光值A2,A=A2-A1计算公式:a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按照样本蛋白浓度计算随活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/mgprot)=A(d)V反总(V样XCPr)T=321.54ZkACpr(2)按照样本质量计算酶活单位
5、定义:每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/g鲜重)=A(d)XV反总(WV样V样总)T=321.54AAeWV反总:反应体系总体积,0.2mL;:NADH摩尔消光系数,6.22103L/mol/cm:d:比色皿光径,1cm:V样:加入样本体积,0.02mL:V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,gb.用96孔板测定的计算公式如下(1)按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义:每亳克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/mgprot)=A(d)V反总(V样XCPr)T=643.08ACpr(2)按照样本质量计算酶活单位定义:每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。TPI(nmol/min/g鲜重)=A(d)XV反总(WV样+V样总)T=643.08AWV反总:反应体系总体积,0.2mL;:NADH摩尔消光系数,6.22103L/mol/cm:d:比色皿光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02mL:V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g