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1、常用免疫学相关实验技术及方法,第一节 免疫学方法概论,一、免疫学方法的发展史1976年：Jenner发明了接种牛痘方法预防天花 2个世纪后被广泛接受，1979年（WHO）天花灭迹。19世纪末期：koch病原体是感染性疾病病因 促进了实验免疫学的发展。,19世纪80年代：Pasteur预防鸡霍乱的疫苗 狂犬病疫苗1888：Behring发现了抗体 Methchnikoff发现了巨噬细胞20世纪初：发现了调理素，体液因素可影响吞噬细胞功能1900-1930：认识了过敏反应，发现了血清病 Arthus反应，皮肤反应 调理作用，补体结合反应 疫苗研究有了新发展：BCG结核 白喉毒素白喉,1935-19
2、57：抗体纯化，鉴定及测定技术、凝胶内沉淀技术，抗原抗体、免疫电泳等血清血技术1959-1974：放射标记免疫技术、酶标免疫技术、生物素-亲和素标记免疫技术、荧光标记免疫技术、金(银)标记免疫等技术；化学发光免疫技术、免疫分子转染技术、细胞和细胞因子测定技术,20世纪70年代后期：免疫及分子生物学技术发展成熟，单克隆抗体问世，组织相容性抗原、B细胞免疫球蛋白基因重组，T细胞受体1980：PCR技术 生物芯片技术 转基因动物技术,免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程。基本参与单位有：抗原 抗体 免疫细胞和免疫分子,第二节 体液免疫学方法,一、抗原制备1.天然抗原制备(1)粗抗原的提取：冻
3、融法、冷热交替法、超声法(1-2HE)(2)粗抗原纯化：选择性沉淀法：盐析沉淀法、核酸沉淀法凝胶过滤和离子交换层析亲和层析法蛋白电泳,2.合成抗原制备化学合成高分子氨基酸聚合物，即多肽。合成肽与载体蛋白连接后能有效诱导抗体产生免疫应答常用方法：tea bag method纯化方法：反向高效液相色谱法,二、抗体制备1.多克隆抗体制备(polyclonal antibody)多克隆抗体是指在自然免疫或免疫动物后产生的具有不同特异性和亲和性的多种抗体混合分子。具有抗多种不同抗原的表位。,2.单克隆抗体制备(monoclonal antibody)单克隆抗体是指由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的
4、同源抗体。产生方法：B细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞,3.基因工程抗体(engineer antibody)应用抗体库技术产生方法：将某种动物所有抗体的可变区基因克隆到质粒或噬菌体中并表达，然后利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆，从而获得特异性抗体。,三、抗体的应用及其相应的免疫学技术(一)ELISA ELISA的基本原理是利用酶标记抗体或抗原，使之成为酶标抗体(或抗原)。这种酶标抗体或抗原既保留其免疫原性，又保留酶的活性；中外，使抗原或抗体固定到某种固相载体表面并保持其免疫活性，利用抗原、抗体复合物的免疫学反就原理来测定未记标的抗原(或抗体)。具体操作时是把受检标本(检测
5、其中的抗体或抗原)和酶标抗原蔌抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，经洗涤后使固相载体上形成的抗原、抗体复合物与其他物质分开，最后结合到固相载体上的酶量与标本中的受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，其量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据反应颜色的深浅来进行定性或定量分析。,(二)放射免疫测定(radioimmunoassay)放射免疫测定通常用于测定组织液和血液中的激素水平。放射免疫分析多数用125I来标记抗体。被检测抗原即未标记物，通常吸附在固相载体中，如多孔酶联塑料板或试管中。在此固相载体中标记的特异性抗体与特定的未标记抗原产生特异性免疫
6、结合。非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或洗涤液来封闭。未结合的标记抗体则用洗液去除。最终特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中。用125I标记的抗体，其放射性强度可以直接测定。,(三)免疫荧光技术(immunofluorescence technology)免疫荧光技术的原理是将荧光色素与特异性抗体(或抗原，但少用)以化学的方式结合起来，但不影响该血清抗体的免疫特性。而后将荧光标记了的抗体作为一个试剂，在特定的条件下浸染标本，使之与标本中相应的抗原产生结合反应。这个反应的结果含有荧光标记的抗原、抗体结合物，可用荧光显微镜来观察之。,(四)免疫组织化学技术(immuno
7、lhistochemistry)检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的另一种方法(类似于免疫荧光技术)为免疫组织化学技术。该方法是用化学的方法将酶与抗体结合起来(类似于ELISA)，然后将标记的抗体与组织切片中的抗原产生特异性的结合。结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色酶底物通过化学反应呈色，最终借助显微镜在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质及其分析。,(五)免疫印迹技术(immunoblot)免疫印迹技术也称Western blot或蛋白印迹技术(protein blot)，是20世纪70年代末80年代初发展起来的一种蛋白质抗原检测新技术。其基本过程是将蛋白质样品(如血清或细胞组织
8、碎片)在凝胶电泳中分离，再通过电转染将已分离的蛋白南分子转移到固相膜上，然后在固相膜上用标记(放射标记或酶标记)的特异性抗体检测蛋白质抗原煤。免疫印迹技术结合了凝胶电泳分辩力高和固相免疫测定敏感、简便、稳定等优点。,(六)免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，是一加快了没淀反应的速度，二是将一些蛋白质组分利用其电荷的不同将其分开，再分别与抗体反应，以其沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。1.免疫电泳 2.对流免疫电泳 3.火箭免疫电泳 4.免疫固定电泳 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳,第三节 细胞免疫学技术,一、白细胞的分离 血液中红细胞与白细胞比例为600:
9、11000:1，两者的比重不同，其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。1.自然沉降法 2.聚合物加速沉降法,二、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.09左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为，血小板为。为此利用一种密度介于之间而近于等渗透的溶液(分层液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分Ficoll和Percoll两种。,三、淋巴细胞及其亚群的分离纯淋巴细胞的采集黏附贴壁法磁铁吸引法,四、淋巴细胞亚群的分离E花环沉降法尼龙毛分离法亲和板结合分离法荧光激
10、活细胞分离仪分离法流式细胞分选法,五、淋巴细胞的功能分析(一)T细胞功能的检测T细胞转化试验(1)非抗原性刺激物(2)抗原性刺激物,2.细胞杀伤试验(1)形态学检查法(2)放射性核素法,(二)B细胞功能的检测B细胞早期活性指标的测定溶血空斑形成试验B细胞增殖能力的试验,(三)NK细胞能力的检测形态法酶释法荧光法放射性化学发光法,(四)吞噬细胞的检测中性粒细胞功能的检测(1)细胞运动功能检测(2)吞噬和杀菌功能的检测2.巨噬细胞功能的检测(1)炭粒廓清试验(2)吞噬功能的检测(3)巨噬细胞溶酶体酶的测定,第二十二章,常用分子生物学相关实验技术及方法,第一节 聚合酶链反应,一、PCR技术原理 PC
11、R是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板进行加热变性。随之将反应混合特冷却至某一温度，使引物与它的靶序列进行配对，称为退火。嗣后，退火引物可在DNA聚合酶作用下进行延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。,(一)高温变性 基因组模板DNA加热至90-95度，可使DNA双螺旋结构解链成为单链。(二)低温退火 将反应混合物降温，使引物与单链DNA
12、模板(或从mRNA反转录而来的cDNA)上的互补序列得性，形成模板-引物复合物谷称退火，是DNA复制的固定起点。(三)中温延伸 在DNA的合成过程中，链的延伸温度在60-72度。,二、PCR分类经典PCR反转录PCR免疫PCR,第二节 生物芯片技术,生物芯片是指在面积不同的基片（玻璃、硅片、尼龙膜、金属、凝胶等）表面上有序地点阵排列了一系列识另分子(cDNA、DNA、肽、蛋白质或寡核苷酶等)，固定在每一点阵上的分子都是可寻址的；然后在相同条件下，点阵上的分子与其“配体”分子反应，反应结果用核素、荧光、化学发光或酶标法显示，通过计算机软件分析，综合在可读的IC总信息。,第三节 转基因动物,一、转
13、基因动物的概念及发展史转基因动物(transgeni animal)是指所有细胞基因组中稳定地整合由人工导入的外源基因，能正常表达并能遗传给后代的一类动物。仅有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物(chimera animal)。,二、转基因动物技术 转基因动物技术的基本原理：将经过基因工程改造过的目的基因（或基因组片段，或人工染色体），用不同的基因转移方法导入供体动物的受精卵（或早期胚胎细胞），然后将此卵或细胞植入代孕母体动物的输卵管（或子宫）中，使其孕育成熟，产下携带有外源基因的转基因动物。,产生转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的获得和构建（含人工染色体）；将外源目的基因有效地导入生殖细胞或胚胎干细胞；利用合适的宿主动物或体外培养系统，使转基因胚胎发育；鉴定、筛选理想的转基因动物品系。,制备转基因动物的转基因方法主要包括：显微注射法胚胎干细胞法反转录病毒载体法精子载体法其他方法,
