常规石蜡制片HE染色技术.ppt

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1、光镜下观察组织标本需克服的几个问题,如何保持组织标本取材前的形态？如何制备薄组织片，允许光的通过而便于 观察？如何使不同组织结构具有不同的光折射 率，便于对标本进行结构的仔细辨别？,光镜标本的基本制作技术,第二章,光镜样本的基本制作技术（组织制片技术）是医学研究和生物学研究中，观察细胞、组织的正常或病理形态变化的一种必不可少的手段，借此可以弥补活体观察的不足 同时光镜样本的基本制作技术也是其它光镜标本技术的基础,取材 固定 漂洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 脱蜡 染色 脱水 透明 封片,光镜样本的制作的基本过程,第一节 取材及固定,医学研究的组织样本来源 人体（最好）临床的活检组织 尸检组织

2、（取材方法及注意事项按病理学要求进行）正常组织 用正常动物的组织材料替代,一、动物致死法,动物的福利，3R原则 动物致死法选择 致死动作应迅速,1断头法 2击头法 3麻醉法4股动脉放血法 5空气栓塞法,动物致死方法,细胞标本制备,1.印片法 2.穿刺法 3.沉淀法 4.培养细胞标本制备,二、取材及注意事项,1材料保持新鲜2组织块免受挤压3组织块力求小而薄 4尽量保持组织的原有形态5选取好组织块的切面 6动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置7切除不需要的部分8保持材料的清洁,三、组织固定法,固定是使要观察的组织构造尽量接近它取材前的状态,（一）固定目的 1标本不发生离开身体后或死后变化 2随后处理

3、中，标本不易损坏 3.组织块硬化 4使组织内各种结构产生不同的折光 率，或对染料具有不同的亲和力,（二）固定方法 1蒸气固定法（较细小而薄的标本）2小块组织固定法（直接投入固定液中）3注射、灌注固定法（体积过大或固定 液极难渗入内部的组织标本）（1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等）（2）全身灌注固定（小鼠、大鼠、兔、狗、猴、人）4.微波固定法,灌注过程 充分暴露心脏 针尖插入左心室或升主动脉中 快速灌注生理盐水 剪开右心耳（或右心房）放血 换灌固定液，先快后慢输入,用量 1.生理盐水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、猫200-250ml、猴300-500ml、狗800-1000

4、ml 2.固定液 动物血液量的2倍 动物体重（g）7%20（ml）,无论是局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完毕后，必须立即将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行后固定,1组织块不宜过大 2软组织或较大块组织可先经23小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定 3固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸 4固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组织块的大小而定,（三）固定注意事项及影响因素,1甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是37%40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓度是10%，而实际甲醛浓度只有4%固定小块组织(15152m

5、m)10小时左右 经它长期固定的组织，需经2448小时的自来水流水冲洗,四、固定液（一）单纯固定液,甲醛单纯固定液的常用配方 10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 自来水或蒸馏水 90ml 10%甲醛生理盐水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 氯化钠 0.85g 自来水或蒸馏水 90ml,2多聚甲醛：一种渗透速度极快的甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是新配制的甲醛液，宜临用前配制,4%多聚甲醛单纯固定液的常用配方 多聚甲醛 4g 蒸馏水（或0.2 mol/L PB）50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后

6、冷却 0.2 mol/L PB（或蒸馏水）100ml,3戊二醛：一种常用的醛类固定剂，能较好的保存组织结构，但其穿透力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用时需配制成1%6%的不同浓度,4酒精：单纯固定液为80%95%的浓度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学中的糖原固定 酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒精除外）可作为配制混合固定液的基本成分,5 其它固定液 丙酮 苦味酸 醋酸 重铬酸钾 三氯醋酸 铬酸 氯化汞 锇酸,用多种具有固定作用的试剂混合配制的固定液，达到各试剂在固定作用中具有的优缺点平衡目的,（二）混合固定液,常

7、用混合固定液,1酒精-甲醛液（A-F 液）95%或无水酒精（A）90ml 37%40%甲醛液（F）10ml 2Carnoy液 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml 无水酒精 60ml3Bouin 液 饱和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（37%40%）25ml 冰醋酸 5ml,4Helly 液 重铬酸钾 2.5g 升汞 5g 蒸馏水 100ml（以上是Helly储存液）甲醛液(37%40%)(临用时加入)5ml 51%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液 多聚甲醛 1g 蒸馏水 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 25%戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4）100ml,第二

8、节 固定后处理及切片,一、组织修整 固定结束后，将受挤压或不需要的部分组织修切或整形，同时选择好包埋面，称组织修整。修整可在冲洗前、也可放在冲洗后,二、组织洗涤,洗去渗入组织内的固定液，再进行下一步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生化学反应造成后道操作困难 1水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤 2酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，多采用酒精洗涤,三、组织脱水,（一）脱水意义与脱水剂 因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块

9、中的水分，称脱水 脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任意比例互相混合,脱水剂中最常用的是酒精。一般从70%酒精开始脱水，逐步升高酒精浓度；脱水时间根据组织块的种类、大小、及使用的固定液种类等因素而定,70%酒精 25小时(可长期保存组织)80%酒精 25小时 90%酒精 25小时 95%酒精（）25小时 95%酒精（）25小时 无水酒精（）30分钟 无水酒精（）30分钟 无水酒精（）30分钟,（二）脱水步骤和时间 以18mm18mm，厚约23mm的组织块 为例，其脱水步骤和参考时间如下,（三）脱水注意事项 1组织脱水必须

10、掌握由低浓度逐步 过渡到高浓度的原则 2脱水时间要适度 3组织脱水要彻底干净,四、透明,（一）透明意义及透明剂 组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透明状，故称透明 二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜，较大组织块适当延长但不超过2小时,（二）透明步骤和时间 为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精之后，先经过酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入纯二

11、甲苯中 透明步骤和时间大致如下 1无水酒精:二甲苯=1:1 2030分钟 2二甲苯（）2030分钟 3二甲苯（）2030分钟,（三）透明注意事项 二甲苯必须保持无水 组织块脱水过程要彻底,五、浸蜡,（一）浸蜡目的 浸蜡是将透明过的组织块在熔化的石蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替组织块中的二甲苯，在随后温度下降中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切片机切片,第1杯熔蜡(软蜡)(熔点54以下)1小时 第2杯熔蜡(硬蜡)(5860)1小时 第3杯熔蜡(硬蜡)(5860)30分钟 整个浸蜡时间控制在3小时之内 浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高 于石蜡熔点 23,（二）浸蜡的步骤,（三）浸

12、蜡注意事项 1浸蜡最佳温度应是石蜡刚熔化、或蜡杯底部 尚残留小部分未熔完蜡时的温度 2浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和 标签一齐装入分格篮内浸蜡 3石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质 4浸蜡用的石蜡要定期更换 5新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使 其中的挥发性物质蒸发 6包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免 石蜡无益地加温熔化,六、包埋（石蜡包埋法）,（一）包埋目的及包埋剂 包埋是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片 石蜡是组织学切片技术中最常用的包埋剂,（二）包埋过程 1取预热包埋框

13、及金属板，搭成包埋模具 2.迅速倾注少量熔蜡于包埋框中 3.从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底 4.加熔蜡至包埋框上缘，将标签纸紧贴旁边 5.表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固 6.凝结蜡块自动漂浮于水面，或30分钟后推开 包埋框，取出蜡块。7.修块,（三）包埋注意事项 1包埋蜡的熔点选择 2石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性 3包埋用石蜡和最后浸蜡的石蜡熔点要 相同 4包埋中组织块间要有一定距离 5石蜡凝固要快速,七、切片,（一）石蜡切片机及切片刀 1石蜡切片机 最常用的石蜡切片机是轮转式切片机，它的切片刀固定不动，而靠右侧旋转的重轮带动螺纹轴和齿轮，将组织块夹具

14、按所调节的切片厚度向前推进，并在上下平面运动，让组织块经过前下方切片刀而切成一定厚度的切片,2切片刀与磨刀 石蜡切片常用的切片刀为平楔型切片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两种,（二）石蜡切片过程 1修块 2蜡块和切片刀固定 3调整蜡块切面和切片刀角度(10以内)4.调整刀台与标本台距离 5.修整蜡块切面，暴露完整组织切面 6.调整切片厚度调节器(厚度为68m)7.正式切片 8切片展平 9贴片和烘片,（1）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高（2）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬（3

15、）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或 不平（4）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利（5）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小（6）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或 刀或蜡块未固定牢（7）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一（8）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好（9）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角度过小、刀口不锋利（10）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小（11）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥,（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因,第三节 苏木素-伊红染色方法,染色是将组织浸入染料配制的染色液中，使组织中的不同结构染上

16、不同颜色或不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构造,染料是一类有色的以苯环为基础的有机化合物，它不同于一般颜料，因为它不但有颜色，更重要的是它对组织的不同成份具有不同的亲和力。构成染料至少必须有两种原子团连接于苯环上，即能使染料显色的原子团-发色团和能使染料对不同组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团（酸、碱性基团）-助色团,分类 细胞核染料有天然染料苏木素、胭脂红及人工合成的染料结晶紫、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、焦油紫等 细胞质染料有人工合成的伊红Y、酸性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等,媒染剂为有些二价或三价金属物质，如铝、铁、铜、钨等可作为中介媒体物质，使原来

17、几乎不与组织结合或结合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）着色；它主要是通过增加染料对组织中某一成份的亲和能力，自身又与染料或组织发生结合而发挥作用,助染剂（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染 料的染色能力，而自身不参与染色反应 分化剂（脱色剂、分色剂）用于退行性染色 法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色 酸性分化剂 0.51%的盐酸酒精（95%以 下）或较稀的冰醋酸水溶液 氧化分化剂 苦味酸、铬酸、重铬酸钾、过锰酸钾等 媒染分化剂 既能促使组织和染料结合，又可使已经结合到组织上的染料脱离,一、苏木素-伊红染色的基本原理,苏木素和伊红染色是组织学中常规制片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，故称

18、常规染色（简称HE染色）,苏木素（或苏木精）是一种天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强它对组织的亲和力，达到染色目的 伊红（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质染料；有伊红Y、B、BN等，常用的是伊红Y。伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需加助染剂和分化剂，使染色效果更加好,二、苏木素-伊红染液的配制,（一）苏木素染液 一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、硫酸铝

19、钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素中配成溶液 另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用媒染剂分色,Harris苏木素染液 苏木素 1g 无水酒精 10ml 硫酸铝钾（或硫酸铝铵）20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5g,Mayer苏木素液 苏木素 1g 蒸馏水 1000ml 碘酸钠 0.2g 硫酸铝钾 50g 枸橼酸钠 1g 水合氯醛 50g,醇溶性伊红染液 伊红Y 0.5g 95%酒精 100ml 水溶性伊红染液 伊红Y 0.5-1g 蒸馏水 75ml 95%酒精 25ml 冰醋酸 12滴,（二）伊红染液,（三）分化液,去除过度染色或不需要着色的组织成份上颜

20、色的过程，叫分色所使用的试剂配制的液体称为分化液而苏木素的分化过程中，使酸性条件转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由红色转变成蓝色，所以这一过程又称蓝化,1氢氧化铵水溶液（pH 7.5-8.0）氢氧化铵（氨水）3ml 蒸馏水 1000ml 21%盐酸酒精溶液 盐酸 1ml 70%酒精 99ml,三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、脱水和透明等的作用,石蜡 去石蜡 去二甲苯 水化 颜色 二甲苯 酒精 水 染液 透明 脱水 水分 二甲苯 酒精,四、染色程序,（一）脱蜡至水 石蜡切片 冰冻切片 1二甲苯（）5分钟 2二甲苯（）5分钟 3无水酒精（）5分钟 4无水酒精（）5分钟 595%酒精 5分钟 680

21、%酒精 1分钟 770%酒精 1分钟 8自来水 2分钟 3分钟 9蒸馏水 1分钟 1分钟,（二）染色 石蜡切片 冰冻切片 1苏木素液 5-15分钟 1-2分钟 2自来水洗 1分钟 30秒 3酸性分化液（镜下控制）30秒 20秒 4自来水蓝化 20分钟 20秒 5稀氨水 30秒 6.蒸馏水 10秒 20秒 770%酒精 3分钟 3分钟 880%酒精 3分钟 3分钟 9沉淀酸化伊红乙醇液 30秒 30秒,（三）脱水、透明和封片 石蜡切片 冰冻切片 195%酒精（）1分钟 1分钟 295%酒精（）1分钟 1分钟 3无水酒精（）5分钟 3分钟 4无水酒精（）5分钟 3分钟 5无水酒精（）5分钟 3分钟

22、 6无水酒精+二甲苯（1:1）5分钟 3分钟 7二甲苯（）5分钟 3分钟 8二甲苯（）5分钟 3分钟 9二甲苯（）5分钟 3分钟 10中性树胶封片,五、染色注意事项,1染色前需烘烤切片，并立即进行染色 2切片脱蜡后，应保持切片在液体中，防止干燥。脱蜡温度应在25左右环境中进行，时间可适当延长 3获得好的染色效果，需选择合适的固定液和固定时间 4染色时间应根据染液的种类、新旧、组织种类、固定液种类及环境温度等而定 5苏木精染色后，分色和蓝化应在显微镜下进行，以细胞核染色清晰，而胞质等基本无色为佳,6伊红水溶液染色的切片，易被低浓度酒精脱水时洗掉。最好在脱水至95%酒精时，进行伊红乙醇液染色，然后脱水透明 795%酒精及无水酒精的脱水一定要彻底，若切片进入二甲苯时出现混浊或白色不透明，表明脱水不彻底，应重新退回到无水酒精中再脱水；如仍不透明，则应更换无水酒精 8透明时间要保证，可用石碳酸-二甲苯进行透明 9封片的盖玻片要大于切片；封片剂滴加量适宜；避免气泡。封片后应在恒温箱中烘烤10小时,谢谢大家！,