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1、第十一章 氨基酸与蛋白质 药物的分析,第一节 氨基酸类药物的分析第二节 蛋白质类药物的分析,（一）氨基酸的通式：-氨基酸,一.氨基酸的结构与分类,为什么称为氨基酸？与羧基相邻的碳原子上都有一个氨基。,羧基,氨基,组成蛋白质的常见氨基酸共有20 种,硒代半胱氨酸,I 非极性氨基酸,什么叫非极性氨基酸？,I 非极性氨基酸,I 非极性氨基酸,II 非解离的极性氨基酸,II 非解离的极性氨基酸,III 酸性氨基酸,IV 碱性氨基酸,氨基酸的理化性质,一般物理性质,氨基酸的酸碱性质,氨基酸的化学反应,氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。,氨基酸熔点一般在200300C。,氨基酸的溶解度：水中溶
2、解度 差别大，能溶解于烯酸、烯碱，不溶于有机溶剂,各种氨基酸有不同的味感（味精：谷氨酸钠）,（一）一 般 物 理 性 质,构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子（-碳是一个手性碳原子），在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,-氨基酸有两种构型:D构型和L构型 它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L甘油醛（或L乳酸）构型相同的，就定义为L氨基酸，反之为D氨基酸。,蛋白质中的氨基酸都是L-型。(Gly除外),（1）氨基酸的光学活性和光谱性质,以丙氨酸为例：,旋光性：,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光
3、性，能使偏振光的偏振面向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。,当将等量的右旋体和左旋体混合时，两者的旋光能力相同，但方向相反，旋光作用互相抵消，旋光性消失。此混合物称外消旋体.,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区（200nm）都有光吸收.但芳香族氨基酸因为其R基含有苯环共轭键系统，在近紫外区(200-400nm)酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。蛋白质一般在280nm有最大光吸收，可用来测定蛋白质浓度。,氨基酸的光吸收：,分光光度法的原理是Lamber-Beer(朗伯比尔)定律：A=log I0/I=-log T
4、=cl T=I/I0 A：吸光值（absorbance）（光密度,optical density,OD）：摩尔吸收系数（摩尔消光系数）c：摩尔浓度 l：比色杯的内径或光程厚度 I0：入射光强 I：透射光强 T：透光率,不同蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的摩尔吸收系数是完全不同的,（2）氨基酸的酸碱性质,1、氨基酸的两性离子形式,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,不带电形式,两性离子形式,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质
5、子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。,As an acid（proton donor）：,As a base（proton acceptor）：,2、氨基酸的解离,（3）氨基酸的化学反应,与亚硝酸反应,这是Van Slyke（范斯来克）法测定氨基酸的基础。,测量氮气的体积可计算氨基酸的含量。,3.1-氨基参加的反应,与酰化试剂反应,这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。,（1）与2，4二硝基氟苯的反应,在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基容易与2，4二硝基氟苯的反应（DNFB）作用，生成稳定的黄色2，4二硝基苯氨基酸（简写DNP氨基酸）。,DNP-氨基酸（黄色）,烃基化反应
6、,（sanger反应）,3.2 与异硫氰酸苯酯的反应,在弱碱条件下，氨基酸中的氨基和可以与异硫氰酸苯酯（PITC，Edman（埃德曼）试剂）反应，生成苯胺基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,PITC,（Edman反应）,氨基酸与异硫氰酸苯酯的反应的应用多肽链N-末端氨基酸残基的鉴定（Edman法）,蛋白质多肽链的N-端氨基酸在弱碱条件下也可以与PITC起反应生成PTC蛋白质，在酸性溶液中，末端的PTH氨基酸被释放，形成了少一个氨基酸的多肽链。PTH氨基酸可以用乙酸乙酯抽提，用纸层析进行鉴定，确定肽链N-端氨基酸。重复应用这种方法就可以测出多肽链N-端的氨基酸顺序。,多肽序列自动分析仪的工作原理基
7、于此反应。,成盐和成酯反应,（2）-羧基参加的反应,氨基酸乙酯的盐酸盐,在特定的化学反应中保护羧基，活化氨基。氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物,成酰氯反应,这个反应可使氨基酸的羧基活化，使它容易与另一氨基酸的氨基结合，用于多肽人工合成。,脱羧基反应,在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物,Pro的茚三酮反应呈黄色,-氨基和-羧基共同参加的反应,与茚三酮的反应,-氨基酸与水合茚三酮试剂共热，可发生反应生成紫化合物。反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量，均可作为氨基酸定量分析依据。用途：常用于氨基酸的定性或定量检测。-氨基和-羧基共同参加的反应,脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮
8、反应产生黄色物质,水合茚三酮,3.3 侧链R基参加的反应,1.酪氨酸可发生碘化、硝化、重氮反应，后者可用于检测酪氨酸。2.组氨酸可发生重氮反应。3.精氨酸可与环己二酮发生缩合反应，曾被用于氨基酸序列分析。4.色氨酸可被N-溴代琥珀酰亚胺氧化，生成有色化合物，可用于色氨酸定量测定。5.半胱氨酸可生成烷基衍生物，可用于巯基的保护。巯基可与重金属生成盐，使蛋白质失活。巯基在空气中可被氧化，金属离子对此有催化作用。6.胱氨酸的二硫键可被还原为两个巯基。也可以被过甲酸氧化成两个磺酸基。,侧链R基参加的反应其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。,Pauly(波利)反应，可用于检测酪氨酸。,半胱氨酸侧链上的巯
9、基（-SH），反应性能很高，在微碱性pH下，-SH基发生解离形成硫醇阴离子（-CH2S-）。并可进一步与烷化剂反应生成稳定的烷基衍生物：,与乙撑亚胺反应,可用于序列测定(为胰蛋白酶提供了一个新位点)。也可用来保护肽链上的SH基，以防止被重新氧化为二硫基。,胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。如过甲酸和巯基化合物,二、蛋白质,氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种L-标准氨基酸（standard amino acids)组成。,蛋白质的氨基酸组成,二、蛋白质的性质,高分子有机物两性电解质双缩脲反应福林酚反应紫外吸收 280,蛋
10、白质为高分子有机物,蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，另外还具有扩散和沉降作用，粘度大和不透过半透膜等。沉降常数（S）：是单位引力场的沉降分子下降速度。扩散常数（D）：指单位浓度梯度、单位时间和单位扩散面积时的扩散量。粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质的分子量和形状。,蛋白质为两性电解质,蛋白质分子至少具有一个自由氨基和一个自由羧基，具有两性解离性质。在水溶液中蛋白质的等电点一般偏酸。由于蛋白质的两性性质，可以进行蛋白质电泳、离子交换。,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值
11、即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。,双缩脲反应,双缩脲试剂的成分:浓度为0.1 gmL的氢氧化钠溶液和浓度为0.01 gmL的硫酸铜溶液。碱性溶液中，双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物。,双缩脲反应,蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物,红紫色络合物,(硷性溶液),Cu2+,福林酚反应（Lowry）,包括两步反应：（1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质铜络合物；（2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm比色测定的灵敏度比双
12、缩脲法高100倍。该法适于微量蛋白的测定。,蛋白质的紫外吸收光谱,蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,第三节 鉴别与检查,一、氨基酸鉴别,茚三酮：溶液均显蓝紫色。旋光性：薄层色谱鉴别法：紫外光谱鉴别：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在紫外区有最大吸收。红外光谱鉴别：压制成溴化钾片，在4000667 cm-1范围内测定吸收图谱。,二、蛋白质类药物的鉴别,茚三酮：溶液均显蓝紫色。紫外光谱鉴别：280nm在紫外区有最大吸收。,三 检查,一般检查蛋白质检查有关物质纯度,蛋白质药物的分析,一、蛋白质纯度测定。二、蛋白质分子
13、量测定。三、蛋白质药物的含量测定。四、蛋白质组成氨基酸的分析,蛋白质纯度方法,1、层析纯2、电泳纯3、免疫化学法4、其它方法（分光光度法，酶活力，超速离心沉降）,蛋白质分子量测定,超离心沉降速度离心沉降平衡凝胶过滤柱层析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法,第三节 氨基酸的含量分析,（一）茚三酮法（二）三硝基苯磺酸法（三）铜复合物紫外吸收法（四）甲醛滴定法（五）非水溶液滴定法（六）双波长分光光度法（七）导数分光光度法（八）HPLC法,（一）茚三酮法,当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。还原型茚三酮与氨及另一
14、分子茚三酮缩合生成蓝紫色的，最大吸收值的波长为570 nm。测定范围是0.5-50g氨基酸。,（二）三硝基苯磺酸法,TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。中间络合物有二个吸收峰，位于355nm和420nm附近。酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基酸，吸收值移至340nm处。,（三）铜复合物紫外吸收法,在合适的pH条件下，二分子-氨基酸与一分子铜离子形成氨基酸-铜复合物。复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在230nm有最大吸收。测定范围是50-500 mol/ml。适用于蛋白质水解速度和水解程度的测定。,（四）甲醛滴定法,在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的
15、氨基结合，使平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮。,（五）非水溶液滴定法,非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱。弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强。适合于氨基酸成品的含量测定，测定范围是几十毫克的氨基酸。,非水溶液滴定法,直接滴定法：适用于能溶于冰醋酸的氨基酸。丙氨酸、精氨酸、组胺酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。回滴法：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等
16、。,第四节 蛋白质类药物的含量测定,凯氏定氮法 双缩脲法 福林酚法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝G-250法 BCA法,凯氏定氮法,原理：当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸胺，此过程称为“消化”。硫酸铜用作催化剂。消化完成后，消化液转入凯氏定氮仪反应室中，加入过量浓氢氧化钠，使硫酸胺分解放出氨，借助蒸汽蒸馏法，将NH3驱入过量的标准硼酸溶液中，然后用标准盐酸进行滴定，根据所测定的氨量，计算样品的含氮量及蛋白质含量。,反应式,操作方法：,1、样品处理：恒重2、消化：准确称量的蛋白质样品转入凯氏烧瓶消化3、蒸馏和吸收：（1）、洗涤：（2）、加样：（3）、蒸馏
17、吸收：4、滴定：5、计算：样品中总氮量（）（A-B）0.100 14 C 1000A为样品中用去的盐酸平均毫升数，B为空白样品用去的盐酸平均毫升数，C为称样的克数，0.100 为盐酸的摩尔浓度，14为氮的原子量。,凯氏定氮法优缺点,优点：准确，干扰少。注意事项：测试样品中是否还含有其它含氮化合物。适用范围：氮。相对误差小于2。,双缩脲法,原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。540nm比色特点：快速，硫酸胺不干扰，有利于蛋白质纯化的早期步骤测定。范围：110mg蛋白质/ml.,双缩脲法操作,双缩脲试剂：1.5
18、克硫酸铜（CuSO45H2O）6.0克酒石酸钾钠，用500ml水溶解 定容至1000ml 300ml 10NaOH溶液，测定：样品（标准品）1ml，加双缩脲试剂4ml，充分混匀，室温放置30分钟，与540nm比色。,微量双缩脲法,原理：铜与蛋白质的复合物最大吸收峰在260280nm，此区域干扰因素大，因此选择310330nm 测定，比540nm灵敏10倍以上。310nm进行比色测定，测定范围0.11.0mg。330nm进行比色测定，测定范围0.22.0mg。,Folin酚试剂法（Lowry）,原理：蛋白质用碱性铜溶液（酚试剂）处理，使其形成铜蛋白质络合物。该络合物中的酪氨酸、色氨酸能还原磷钼酸
19、磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色。660nm 测定范围0.030.25mg/ml灵敏度为双缩脲法的100倍。,Folin 酚试剂法,Folin 酚试剂法定量蛋白质的方法简单、灵敏，是一般实验室最广泛采用的方法。缺点：蛋白质/蛋白质间测定值差异较大干扰因素多：Tris、EDTA、蔗糖、甘油、糖类、还原剂、金属离子、硫酸胺乙醇、乙醚、丙酮、脂类等化合物对测定有影响。,紫外吸收法,（1）280nm波长的测定法、（2）280nm与260nm吸收差法（3）215nm与225nm吸收度差法的测定法。紫外吸收法是将样品溶液直接在紫外分光光度计下测定的方法。测定后的样品能够回收，操作简单。柱层析蛋白质
20、定量、贵重的蛋白质定量,280nm波长,原理：蛋白质溶液强烈地吸收280nm附近的紫外光，这是由于蛋白质的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸残基而引起的。通常以浓度1mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0进行估算。该法测定范围：0.010.1mg/ml.受pH影响。,280nm与260nm吸收差法,如核酸的含量为蛋白质含量20%以下时，根据在280nm和260nm处的吸收度求出蛋白质的含量。经验式：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A2800.74A260,215nm与225nm吸收差法,肽或蛋白溶液在200225nm的范围内，表现出强烈的选择性吸收，在波长减少时吸收度急剧地增加。主要原因是由于蛋白质的
21、肽键。测定范围：20100g/ml。蛋白质浓度（mg/ml）=0.144（A215A225）优点：用量少，可回收，不必作标准曲线，,考马斯亮蓝G-250法,原理：考马斯亮蓝G-250为一种阴离子染料，与蛋白质结合变为蓝色，595nm处有最大吸收，A595与蛋白质浓度成正比。优点：灵敏度高，显色反应快而且稳定，干扰物质少。测定范围：0.011.0mg 蛋白质/ml。,4-甲酸喹啉法,原理：碱性条件下，蛋白质与两价铜离子反应中生成的CU+。4-甲酸喹啉（BCA）与CU+作用形成紫色络合物，在较广pH范围内，反应生成的颜色与蛋白质浓度成正比(A562nm)。,方法与注意点,方法：蛋白质样液0.1ml
22、与试剂溶液2.0ml混合，37保温30分钟。测562nm处吸收度，标准蛋白平行操作。注意点：BCA法除对还原糖的干扰敏感（糖可将Cu2+还原为Cu+）。灵敏，测定不同种类蛋白质变异系数小。测定范围：0.510g/ml,常用蛋白质定量方法优缺点比较,含量测定方法选择,样品小部分是蛋白质1 样品丰富时（1）凯氏定氮法（2）色素结合法2 样品少时（1）微量凯氏定氮法，（2）色素结合法，（3）Folin 酚试剂法样品大部分是蛋白质1 样品丰富时（1）凯氏法（2）双缩脲法（3）紫外光谱吸收法（280nm）2 样品少时（1）紫外光谱吸收法（215-225nm）（2）色素结合法（3）Folin 酚试剂法（4
23、）微量双缩脲法3 样品连续地产生时（1）紫外光谱吸收法，（2）Folin 酚试剂法（3）微量双缩脲法,蛋白质药物分析实例：胰岛素,本品为自猪、牛等食用动物胰脏提取而得的高纯度蛋白质，是胰脏细胞分泌的激素，能降低血糖，为重要的蛋白质类药品。本品为五十一肽，分子量约5700。晶体胰岛素含锌约0.4%。等电点5.305.35。在pH2.53.5微酸溶液中稳定，微碱溶液中不稳定，遇蛋白酶、强酸、强碱均能破坏。,胰岛素,【性状】本品为白色或类白色的结晶性粉末。在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶，在无机酸或氢氧化钠中易溶。【鉴别】（1）取本品10mg，加用酸调节pH2.53.0水6ml，应能完全溶解，调pH
24、5.3，即发生沉淀，调pH 8.08.5，溶解。（等电点5.305.35）。（2）HPLC：十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，检测波长214。（与同种属对照品主峰保留时间一致）。（3）取本品适量，加用酸调节pH2.53.0的水制成每1ml中含5单位的溶液。在2030条件下，取体重2040g的小鼠5只，按每20g体重皮下注射上述溶液0.25ml，注射后2小时内，至少应有4只小鼠发生惊厥。立即给惊厥的小鼠腹腔注射10%的葡萄糖注射液1ml，使惊厥停止。,检查,吸收度：取本品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml含0.5mg的溶液，照分光光度法测定，在276nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.480
25、.55。有关蛋白质：取胰岛素标准品适量，精密称定，用尿素溶液制成每100l含0.5 g，1.0g，3.0g，5.0g，及100g的溶液。取供试品适量精密称定，用尿素溶液制成每100l含100 g及500 g的溶液照聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，胶条染色后，目测比较各色带的颜色。(1)标准品色带应有明显的梯度；（2）100 g及500 g供试品管，主带位置应与标准品100g主带位置一致；（3）100 g供试品管与标准品100g主带后泳动较快的一条色带，颜色不得深于标准品 3.0 g；（4）500 g供试品管与标准品100g 相应的主带后泳动较慢的一条色带，颜色不得深于标准品0.5 g。,检查,大分子
26、蛋白质：取供试品约100mg，精密称定，用1mol/L醋酸溶液制成每1ml中含50mg的溶液。照柱色谱法，葡聚糖凝胶G-50，色谱柱长80cm、内径2cm；洗脱剂为1mol/L醋酸溶液，检测波长280nm，流速每小时2225ml，供试品溶液加入量为0.6ml。主峰前洗脱的面积之和应不大于所有洗脱峰面积的1%。氮：取本品10mg，精密称定，照氮测定法测定，按干燥品计算，含氮量应为14.516.0%。干燥失重：10.0%。锌：取供试品适量及标准锌溶液，分别置10ml量瓶中，各加硼酸氯化钾缓冲液2ml，新制的锌试剂溶液1ml，用水稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，照分光光度法，在620nm分别测定吸收
27、度，计算每1000单位中的含锌量，不得过0.4mg。,胰岛素效价检测方法,胰岛素效价检测方法较多，目前各国药典比较普遍采用的是生物检测法。近年来国内外所用新的检测方法：放射受体分析 免疫火箭电泳法 高效液相色谱法,检测法,1生物检测法：兔血糖法，此法是将胰岛素标准品和供试品分别注入家兔皮下，比较二者使家兔血糖降低的程度来决定供试品效价。小鼠惊厥法及小鼠血糖法。2、放射受体分析法：灵敏度高，一般能达到ng、pg甚至fg的水平；特异性强，样品中的待测物质不需提取或纯化；简便，可大批检测样品，省人力，便于标准化、药盒化和自动化等。胰岛素与受体结合有饱和性。将碘标记胰岛素后与受体结合，天然胰岛素可以取
28、代与受体结合的碘化胰岛素，当碘化胰岛素与受体的量固定时，碘化胰岛素受体复合物就随天然胰岛素浓度的增加而减少，并呈一定函数关系。3理化测定方法,理化测定方法,（1）紫外分光光度法：重复性好，回收率。（2）火箭电泳法：特异性强，不受其它组分的干扰，适用胰岛素生产的中间检测。（3）高效液相色谱法：1985年Smith等用RP-HPLC法，以标准峰面积对效价作标准曲线，测定了胰岛素的效价。此法样品用量少，并可批量检测，时间仅为生物检测法的1/60，同时还能获得对胰岛素纯度评估必不可少的杂质种类及含量的信息。,高效液相色谱法,层析条件：Monc QRH5/5色谱柱，流动相A：20mmol/L Tris-HCl，流动相B：流动相含0.5mol/L NaCl，检测波长280nm；线性NaCl梯度如下：0min：100%A，0%B；20min：60%A，40%B。,样品测定,标准曲线制备：精密称取胰岛素标准品用流动相A配成浓度梯度。分别进样50l，按上述层析条件进行色谱分析。以胰岛素峰面积对浓度作图，浓度与峰面积成线性关系。样品测定：,
