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1、第三节,高效液相色谱的类型,根据固定相和分离机理不同，高效液相色谱可分为多种类型：,液-液吸附色谱液-固分配色谱化学键合相色谱离子交换色谱离子色谱尺寸排阻色谱,.,一、液固吸附色谱,(一)原理,基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同的吸附能力而进行分离。,当流动相携带试样组分通过吸附剂时，各组分分子和流动相分子与吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易被吸附,结果不同组分由于结构的不同，受到的吸附力也不同，则保留值也不同，最终被分离。,(二)固定相,液固吸附色谱常用的固定相是：固体吸附剂，主要有：极性：硅胶、氧化铝、分子筛 非
2、极性：活性炭,(三)用途,主要用于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适合分离异构体，但不宜分离同系物。液固吸附色谱的分离效果不太好，目前使用较少。,二、液液分配色谱,(一)原理,根据各待测组分在互不相溶的两相中分配系数不同而进行分离的。,在色谱柱中，随着流动相的移动，被分离各组分在固定相和流动相之间的分配平衡需进行多次，造成各组分的迁移速率不同，从而实现分离的过程。,(二)固定相,原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相，常用硅胶做载体。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷
3、(C18)、角鲨烷(SQ)等。,(三)流动相,HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为：,1.正相分配色谱,定义：固定相为极性，流动相为非极性的液液分配色谱称正相分配色谱。用途：主要用于极性组分的分离。流出顺序：被分离组分按极性从小到大的顺序流出，即极性小的先流出，极性大的后流出。,2.反相分配色谱,定义：固定相为非极性，流动相为极性的液液分配色谱称反相分配色谱。用途：主要用于非极性组分的分离。流出顺序：被分离组分按极性从大到小的顺序流出，即极性大的先流出，极性小的后流出。,三、化学键
4、合相色谱,(一)化学键合固定相,是通过化学反应以共价键形式将有机固定液键合在硅胶载体表面，而得到的各种性能的固定相。,(二)优点,(1)固定液不流失。(2)热稳定性和化学稳定性好，能在pH=28.5的介质中使用。(3)消除了机械涂渍固定液表面不均匀 带来的弊病。(4)可键合各种不同类型的固定液，制备适应于各种色谱的固定相。(5)适合于梯度淋洗。,(三)化学键合方法,通常，化学键合相的载体主要是硅胶(表面有硅醇基)：,方法一(硅酯化)：,方法二(氯化)：,方法三(硅烷化)：,特点：,(1)Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等极性溶剂会发生水解，使酯链断裂，因此只适合于不含水或醇的流动相体系。(
5、2)Si-R(或Si-N)：抗水解能力强，热稳定性比硅酸酯好。但所用的格氏反应不方便。(3)Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH=2-8范围内对水稳定。,注意事项：化学键合固定相不适于酸、碱度过大或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相。,(四)原理,这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液-液分配，而是二者兼而有之。化学键合表面的覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,(五)分类,1.正相键合相色谱,正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k减小。,2.反相键合相色谱,分离机理用“疏水效应”来解释。,四、离子交换色谱,此法是利用离子交换原理和液相色谱技
6、术相结合，分离各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适合于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。,1.原理,根据离子交换树脂上可解离的离子与流动相中所带相同电荷的组分离子进行可逆交换，不同组分离子对固定相的亲和力(或离子交换能力)的差别来实现分离的。,2.可逆交换反应,(1)对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+(2)对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O42-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,OH-,F-,阳离子交换
7、：,阴离子交换：,R-SO3-H+M+R-SO3-M+H+,R-NR3+Cl-+X-R-NR3+X-+Cl-,(1)电 荷：电荷越高，结合越牢固，流出越慢。(2)离子半径：半径越大，结合越牢固，流出越慢。,3.固定相,按离子交换剂类型分四种：,把这些离子交换剂用化学键合的方法键合在：(1)微粒硅胶，(2)苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物上，构成固定相。,4.流动相,离子交换色谱常用的流动相是使用一定pH和离子强度的缓冲溶液。可以通过改变流动相pH、缓冲盐类型、离子强度、添加有机溶剂(如甲醇或乙醇)或配位离子来提高选择性。,5.用途,广泛用于无机离子的分离；也可用于有机物、生物物质的分离，如：蛋白质
8、、氨基酸、核酸、糖类等,五、离子色谱,离子色谱(IC)是20世纪70年代发展的新方法。使用强离子交换树脂作为固定相，强电解质溶液为流动相，用电导检测器检测。,1.原理：分离原理与离子交换色谱原理一样。,2.离子交换色谱与离子色谱的关系,离子色谱是在离子交换色谱的基础上派生出来的一种液相色谱。原因：在离子交换色谱中，对于没有紫外吸收的无机离子常需用电导检测器进行检测，但由于使用强电解质为流动相，其在电导检测器上产生强的背景信号，严重干扰待测组分离子的检测。为了解决这一问题，建立了离子色谱。,3.离子色谱如何消除强电解质的干扰,为了消除流动相中强电解质中离子产生的强背景干扰，在分离柱后设置了一个抑
9、制柱，通过抑制柱的交换，将高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，进而消除本底电导的影响，即消除了强背景干扰。,例如：在阴离子分析中,待测阴离子组分随流动相(NaOH)通过阴离子交换柱时，与树脂上的阴离子发生离子交换反应，此时流动相中含大量强电解质NaOH。然后通过设置的强阳离子交换抑制柱，通过交换将高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相(H2O)，消除了本底电导的影响。R-SO3-H+Na+OH-R-SO3-Na+H2O同时使试样中的阴离子(A-)转变为相应的酸(HA)，由于H+的淌度比Na+大的多，因此，大大提高了待测阴离子的检测灵敏度。R-SO3-H+Na+A-R-SO3-Na+
10、H+A-,六、尺寸排阻色谱(凝胶色谱),凝胶色谱是基于试样中各组分分子的大小和形状的不同来实现分离的。,1.原理,固定相为化学惰性的多孔凝胶，凝胶内有许多不同尺寸的孔穴，试样中分子体积大的组分不能渗入孔穴中而被排阻，因此它们直接通过柱子，较早地被淋洗出来，首先在色谱图上出现；另一些尺寸小的分子则完全渗透，进入凝胶的所以孔穴，这些组分在柱中保留值最大，则最后流出色谱柱；试样中中等尺寸的分子则可渗透到凝胶中的某些孔穴中，而不能进入另一些孔穴，所以以中等速度通过色谱柱，即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。,2.固定相和流动相,3.流动相的要求,能溶解试样且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度)。,4.用途,分离相对分子量大于2000的化合物。如有机聚合物、蛋白质和其它生物高分子等。也可用来测定高分子聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布，研究聚合机理。,八、色谱分离方式的选择,1.相对分子量(400)：采用气相色谱分离。2.相对分子量(2000)：选用凝胶色谱3.相对分子量(4002000)：具体情况具体分析。,表5-8 色谱分离方法选择参考表(p355),
