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1、实验二 常见细菌种属的鉴定,一、目的要求二、基本原理三、器材四、操作步骤五、实验报告,一、目的要求,1、了解常见细菌种属的鉴定程序2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法,二、基本原理,（一）微生物分类鉴定的方法多相分类法 多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水平上的分类单元的描述和定义。,1、传统分类法,也称描述分类，主要指以形态特征、培养特征以及生理生化
2、特征等表观分类指征，对微生物分类单元进行的描述分类。传统分类是认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础。,是随着信息数字化时代的发展，根据微生物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助定义微生物分类单元的一种方法。主要是向分类学家提供准确的、可重复的、大信息量的处理手段。,2、数值分类,3、化学分类,是研究微生物细胞不同化学特性，并利用这些特性对生物个体进行分类和鉴定。由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主要方法之一。,3、化学分类的常用方法,细胞（壁）化学组分分析枝菌酸分析（诺卡氏菌）磷酸类脂分析脂肪酸组分分析醌组分分析全细胞蛋白SDS-PAGE分析核糖体
3、蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）,4、分子分类,从分子水平上，对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分类的方法。DNA G+mol%DNA 分子指纹分析DNA-DNA杂交核酸序列分析（16srDNA、ITS等）,（二）微生物的生理生化反应,1、淀粉水解实验2、糖发酵试验3、MR（甲基红）4、V-P（伏-普）,1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能力不同，说明它们有着不同的酶系统。淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。,2、糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道菌的鉴定上
4、尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能产酸和气体，有的只产酸不产气。发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管中有无气泡来证明。,3、MR（甲基红试验）用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。,4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳
5、性。,菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌2、培养基固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基葡萄糖蛋白胨水培养基等3、仪器或其他用具,三、器材,淀粉水解试验将固体淀粉培养基溶化后冷却至50，无菌操作制成平板。用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。37 倒置培养24-48小时观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugols碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以初步判断菌体解淀粉的活性。,四、操作步骤,2、糖发酵试验用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表
6、明培养基名称和所接种的细菌菌名。取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管3支，操作同上。接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接过种的和作为对照的6支管均置于37培养2448小时。观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。,3、MR、VP试验配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色者为阴性。取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加入510滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温1530分钟，以加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。,记录实验结果P 118.1；P120.1；P123.1根据实验结果推测1、2、3号菌种分别是何菌？思考题（1）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？（2）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？（3）为什么大肠杆菌是MR阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与V-P试验最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？,五、实验报告,
