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1、基因工程需要的基本条件,用于核酸操作的工具酶（第三章）用于基因克隆的载体（第四章）用于基因转移的受体菌或细胞（第五章）,第三章 用于核酸操作的工具酶(内容：可扩展至回文结构),用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶,回文结构及限制性核酸内切酶部分（PPT）,关于反应体系及注意问题,某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变（P46）Star活性：又称星活性，在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称为Star活性（限
2、制酶的第二活性）。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“”，如EcoR。,几乎所有的限制酶都具有Star活性。Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一步的DNA连接重组。排除方法：排除产生Star活性的条件。如降低反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐浓度下进行反应。,反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。1、底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。DNA纯度；DNA分子构型；（线形DNA超螺旋和环形DNA）识别序列的侧面序列；位点偏爱；DNA甲基
3、化。,1、限制性核酸内切酶反应系统,2、限制性核酸内切酶用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 1酶活性单位（unit或U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1g DNA所需的酶活性。酶活性高的用量少，反之则多。能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。,3、限制性核酸内切酶反应缓冲液包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇(DTT)或-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。,4、限制性核酸内切酶反应温度大多数的最适反应温度是37，而少数酶的最适反应温度高于或低于3
4、7。,附：,5、DNA分子的限制性图谱,限制酶图谱（restriction map）:描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶切法注意（教材P48）：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：1、使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。2、低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、
5、SDS、NaCl等 措施：加大酶的用量，1g DNA 用10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间,2.DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5 GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamHI、Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,3.核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的St
6、ar activity现象EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5 PuPuATPyPy3或者5 AATT3,DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶,大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）（Klenow）酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5 粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列,附：限制性核酸内切酶类型(参考资料)（P34表2-5）型限制酶型限制酶型限制酶,（1）型限制酶（无用）分子量：30万dal左右组成：3种亚基特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。修
7、饰亚基：具甲基化酶活性。限制亚基：具核酸内切酶活性。辅助因子：需Mg2+、ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。,（2）型限制酶（十分有用）分子量：2万10万dal（较小）组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。识别和切割位点：相一致。,（3）型限制酶（无用）组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。R亚基：具核酸酶的活性。辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点3一侧约25bp处切割DNA分子）。,二、型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同
8、的特异核苷酸序列,6个（大多数）：如EcoR 5-GAATTC-3 Hind 5-AAGCTT-3 BamH 5-GGATCC-3,识别序列（P36）,6个：如Asu 5-GGNCC-3（5个）Mbo 5-GATC-3（4个）,6个：如Not 5-GCGGCCGC-3（8个）,有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。如：Sau3A识别：GATC BamH识别：GGATCC,有的限制酶识别多种核苷酸序列。如：Hind识别 4种核苷酸序列：5-CTPyPuAC-3（Py嘧啶碱基C或T；Pu 嘌呤碱基A或G）,类限制酶识别序列特点回文序列（旋转对称或二重互补对称）,限制酶：BamH,该段的碱基序列的
9、互补链之间正读反读都相同单链以识别序列中线为对称轴，左右两侧的碱基互补双链旋转180度后，都能与自身重合。识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。,2.各种限制酶的识别序列具有共同的规律性,3、识别序列出现的概率1/4n（n为识别序列所含核苷酸的数目）,规律：（1）识别序列短，出现概率大；识别序列长，出现概率小（2）富AT的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率高，在富GC的DNA分子中出现的概率低;富GC的识别序列在富GC的DNA分子中出现的概率高，在富AT的DNA分子中出现的概率低;,稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶.在基因操作中使用稀切酶可获得大的
10、片段。,限制酶切割位点DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用或/表示。如：G GATCC、AT CGAT等；少数位点在识别序列两侧，如：GATC、CATG,4、各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平（齐）末端,(b)5（P单链延伸的）粘性末端,粘性末端（粘端）,G 3 5 AATTCCTTAA G,GAATTC,CTTAAG,如：Eco R,5,3,5,3,5,3,5,3,(a)3（OH单链延伸的）粘性末端,CTGCA 3 5 GG ACGTC,5,3,5,3,5,3,5,3,（1）粘性末端和平（齐）末端,平头末端（平端）,CCC GGGGGG CCC,CCCGGG,GGGCCC,如：Smal,5,3,5,3,5,3,5,3,同尾酶（isocaudamer）有些限制性内切酶虽然来源各异，识别序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,（2）两种特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶,同裂酶（isoschizomer）来源不同，但识别序列相同，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。,+,Bam H,+,Bst,（a）切点位置相同,（b）切点位置不相同,
