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1、基因工程菌株的标记与跟踪,GFP基因1、绿色荧光蛋白的来源荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物（绿色荧光）和几乎所有栉水母类的动物（蓝色荧光）在受到刺激时都可以发出荧光。1962年，Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequorea Victoria中分离、纯化出一种荧光物质，称为绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins，GFPs)。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即Aequorea GFP和Renilla GFP(A-GFP和R-GFP）。,2、GFP的
2、特性：A-GFP是球状的蛋白质，分子量为27-30KDa的单体，最高吸收峰为395nm，肩峰为473nm，发射光谱是max=508-509nm。生色团的形成首先是Gly67的氨基对Ser65的羰基亲核进攻而环化成五元环，同时失去一分子水形成咪唑基。在有氧条件下，新的N=C双键促进Tyr66的、-氧化脱氢，从而形成一个连续的电子芳香族系统-生色团。,GFP生色团形成示意图(3和4表示不同pH条件下的两种形式,4和5是同分异构体)成生色团。,3 荧光特性首先，仅以蓝光或紫外光照射GFP就能激发其荧光，并不需要外加任何底物或共作用因子；荧光稳定，不易衰退，只有在过热(65)、过酸(pH4)、过碱(p
3、H12-13)或其它变性剂(如6M胍基盐酸)存在的条件下GFP才会变性，荧光消失。当变性条件去除后，49%-90%以上的蛋白质能够很快复性。更重要的是，它们在很大的pH范围内(pH7-12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。GFP基因的表达并没有物种、细胞种类、位置的限制，而且GFP不论在真核细胞还是原核细胞中表达后，在蓝光照射下都能产生强烈荧光。,4、绿色荧光蛋白的优缺点GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。（1）GFP的优点：检测方便：因为GFP荧光反应不需要外加底物、酶或其它共反应因子，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到，不会损伤正在生长
4、的细胞和组织。荧光稳定：GFP对光致漂白作用有强烈的耐受性，能耐受长时间光照，从而延长了可探测时间。无毒害：GFP对生活细胞基本无毒害。共用性和通用性：GFP的表达几乎没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得了成功的表达，是一种在生物界较为“通用”的基因。其次，因为GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。,（2）GFP的缺点：正因为其荧光反应不是酶反应，所以GFP的检测不是很灵敏，而且不易对其荧光进行定量测定。GFP基因的表达可能有假象存在：细胞本身存在一些可以受光激发的物质，能产生一定量荧
5、光。,5、GFP的用途：（1）GFP基因可以作为遗传标记和报告基因；（2）GFP可用作定位标记；,GFP标记降解菌的生态学研究,DLL-1菌启动子的筛选和GFP标记载体的构建,DLL-1总DNA A：-DNA/Hind marker B-D：The total DNA of DLL-1,DLL-1总DNA的酶切A：DLL-2000 markerB：The total DNA of DLL-1C-E：Sau3Adigestion of DLL-1,甲基对硫磷降解菌DLL-1的GFP发光基因标记,质粒基因文库质量检测V:-DNA/Hind marker U:pRobe-GFP AT:the pla
6、smids of the white colony,基因组文库的质量检测,从以上的质粒电泳均可断定外源片段的插入率为90%。说明所建文库是高质量的，足以满足普通基因文库的构建工作。,在紫外灯下发光的绿色菌落,启动子的筛选,GFP标记载体的构建,GFP标记载体的构建,45阳性克隆,pIJGFP-45,pTRGFP-45,pBBRGFP-45(10倍功率）,用新构建的标记载体对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行GFP发光基因标记,菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLLBR-45 B:DLL-1,菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLL-1 B:DLLTR-45,pBBRGFP-45,pTRGFP
7、-45,DLL-1的标记与验证,DLLBR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析,DLLTR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析,pBBRGFP-45,pTRGFP-45(33倍功率）,甲基对硫磷降解的紫外扫描图谱CK（箭头所指）2.Treatment DLL-1(黑线)3.Treatment DLLBR-45(红线),标记前后的性状比较,降解性状的比较,GFP基因标记的甲基对硫磷降解菌DLLBR-45在土壤及青菜中的定殖研究,定殖检测方法1：共聚焦激光扫描显微镜观测定殖状况 施菌20 d后观察根部的定殖状况，处理的须根和土壤有明显的绿色荧光，而对照只有较弱的自发
8、荧光。放大1000倍时可以直接观察到有大量发光菌聚集在根表面，而对照并没有。,土壤来源:小卫街菜地,植株根际土壤的激光共聚焦扫描图片 A:treatment B:CK,将植株的根部和茎部 分别横切，取多个横切面，放大400倍再观察，发现处理维管束细胞间有发光菌落的定殖，而对照没有。,根横切面,茎横切面,青菜叶柄切面的激光共聚焦扫描图片A:叶柄纵切面 B:叶柄横切面,可见光,紫外光,定殖检测方法2：植株纵剖面平板检测,定殖检测方法3：植株研磨捣碎涂布平板检测,植株根内DLLBR-45的检测A：CK B：treatment,回收的发光菌质粒图谱和酶活验证,A:-DNA/Hind markerB：recovered strainC：inoculating strain,水解酶活性,根外土壤中DLLBBR-45的检测,土壤中DLBBR-45的检测A：CK B：treatment,
