微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt

上传人:牧羊曲112 文档编号:6572909 上传时间:2023-11-13 格式:PPT 页数:25 大小:3.70MB
返回 下载 相关 举报
微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt_第1页
第1页 / 共25页
微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt_第2页
第2页 / 共25页
微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt_第3页
第3页 / 共25页
微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt_第4页
第4页 / 共25页
微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt_第5页
第5页 / 共25页
点击查看更多>>
资源描述

《微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.ppt(25页珍藏版)》请在三一办公上搜索。

1、基因工程菌株的标记与跟踪,GFP基因1、绿色荧光蛋白的来源荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物(绿色荧光)和几乎所有栉水母类的动物(蓝色荧光)在受到刺激时都可以发出荧光。1962年,Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequorea Victoria中分离、纯化出一种荧光物质,称为绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFPs)。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白,即Aequorea GFP和Renilla GFP(A-GFP和R-GFP)。,2、GFP的

2、特性:A-GFP是球状的蛋白质,分子量为27-30KDa的单体,最高吸收峰为395nm,肩峰为473nm,发射光谱是max=508-509nm。生色团的形成首先是Gly67的氨基对Ser65的羰基亲核进攻而环化成五元环,同时失去一分子水形成咪唑基。在有氧条件下,新的N=C双键促进Tyr66的、-氧化脱氢,从而形成一个连续的电子芳香族系统-生色团。,GFP生色团形成示意图(3和4表示不同pH条件下的两种形式,4和5是同分异构体)成生色团。,3 荧光特性首先,仅以蓝光或紫外光照射GFP就能激发其荧光,并不需要外加任何底物或共作用因子;荧光稳定,不易衰退,只有在过热(65)、过酸(pH4)、过碱(p

3、H12-13)或其它变性剂(如6M胍基盐酸)存在的条件下GFP才会变性,荧光消失。当变性条件去除后,49%-90%以上的蛋白质能够很快复性。更重要的是,它们在很大的pH范围内(pH7-12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。GFP基因的表达并没有物种、细胞种类、位置的限制,而且GFP不论在真核细胞还是原核细胞中表达后,在蓝光照射下都能产生强烈荧光。,4、绿色荧光蛋白的优缺点GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。(1)GFP的优点:检测方便:因为GFP荧光反应不需要外加底物、酶或其它共反应因子,GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到,不会损伤正在生长

4、的细胞和组织。荧光稳定:GFP对光致漂白作用有强烈的耐受性,能耐受长时间光照,从而延长了可探测时间。无毒害:GFP对生活细胞基本无毒害。共用性和通用性:GFP的表达几乎没有受体范围的限制,在原核和真核生物中都获得了成功的表达,是一种在生物界较为“通用”的基因。其次,因为GFP较小,只含有238个氨基酸,编码GFP的基因序列也较短,所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率。,(2)GFP的缺点:正因为其荧光反应不是酶反应,所以GFP的检测不是很灵敏,而且不易对其荧光进行定量测定。GFP基因的表达可能有假象存在:细胞本身存在一些可以受光激发的物质,能产生一定量荧

5、光。,5、GFP的用途:(1)GFP基因可以作为遗传标记和报告基因;(2)GFP可用作定位标记;,GFP标记降解菌的生态学研究,DLL-1菌启动子的筛选和GFP标记载体的构建,DLL-1总DNA A:-DNA/Hind marker B-D:The total DNA of DLL-1,DLL-1总DNA的酶切A:DLL-2000 markerB:The total DNA of DLL-1C-E:Sau3Adigestion of DLL-1,甲基对硫磷降解菌DLL-1的GFP发光基因标记,质粒基因文库质量检测V:-DNA/Hind marker U:pRobe-GFP AT:the pla

6、smids of the white colony,基因组文库的质量检测,从以上的质粒电泳均可断定外源片段的插入率为90%。说明所建文库是高质量的,足以满足普通基因文库的构建工作。,在紫外灯下发光的绿色菌落,启动子的筛选,GFP标记载体的构建,GFP标记载体的构建,45阳性克隆,pIJGFP-45,pTRGFP-45,pBBRGFP-45(10倍功率),用新构建的标记载体对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行GFP发光基因标记,菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLLBR-45 B:DLL-1,菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLL-1 B:DLLTR-45,pBBRGFP-45,pTRGFP

7、-45,DLL-1的标记与验证,DLLBR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析,DLLTR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析,pBBRGFP-45,pTRGFP-45(33倍功率),甲基对硫磷降解的紫外扫描图谱CK(箭头所指)2.Treatment DLL-1(黑线)3.Treatment DLLBR-45(红线),标记前后的性状比较,降解性状的比较,GFP基因标记的甲基对硫磷降解菌DLLBR-45在土壤及青菜中的定殖研究,定殖检测方法1:共聚焦激光扫描显微镜观测定殖状况 施菌20 d后观察根部的定殖状况,处理的须根和土壤有明显的绿色荧光,而对照只有较弱的自发

8、荧光。放大1000倍时可以直接观察到有大量发光菌聚集在根表面,而对照并没有。,土壤来源:小卫街菜地,植株根际土壤的激光共聚焦扫描图片 A:treatment B:CK,将植株的根部和茎部 分别横切,取多个横切面,放大400倍再观察,发现处理维管束细胞间有发光菌落的定殖,而对照没有。,根横切面,茎横切面,青菜叶柄切面的激光共聚焦扫描图片A:叶柄纵切面 B:叶柄横切面,可见光,紫外光,定殖检测方法2:植株纵剖面平板检测,定殖检测方法3:植株研磨捣碎涂布平板检测,植株根内DLLBR-45的检测A:CK B:treatment,回收的发光菌质粒图谱和酶活验证,A:-DNA/Hind markerB:recovered strainC:inoculating strain,水解酶活性,根外土壤中DLLBBR-45的检测,土壤中DLBBR-45的检测A:CK B:treatment,

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 生活休闲 > 在线阅读


备案号:宁ICP备20000045号-2

经营许可证:宁B2-20210002

宁公网安备 64010402000987号