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1、生药的安全性评价,第四章,生药含有害物质,内源性有害物质肝毒性成分 肾毒性成分,外源性有害物质,重金属和有害元素农药残留病原微生物二氧化硫黄曲霉素,肝毒性成分,肝毒吡咯里西啶生物碱(heptotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs);是目前已知最重要的肝毒性成分。,野百合碱,千里光碱,毒性来自其在体内(主要是肝脏)的代谢产物代谢吡咯(metabolic pyrroles)，后者具很强的亲电性，能迅速地同有关的酶、蛋白、DNA及RNA结合，引起各种毒性，表现为急性肝炎、严重腹痛、呕吐、腹泻、腹水、肝肿大、黄疸、水肿。,含HPAs的中草药共38种，其中临床常用或较常用
2、的有12种如农吉利Crotalaria sessiliflora L.、猪屎豆C.mucronata Desv、千里光Senicio scandens Bunch.Ham、款冬Tussilago farfara L.、佩兰Eupatorium fortunei Turcz,肾毒性成分,1993年，比利时学者报道了一些长期服用含广防己的减肥药的年轻女性发生慢性肾衰竭，检测发现减肥药中含有马兜铃酸；含马兜铃酸（aristolochic acid，AA）的中草药可引起肾损害；肾脏进行性快速纤维化并伴有肾萎缩；国外称为“中草药肾病”（Chinese herbs nephropathy，CHN）；国内学
3、者建议将其称为“马兜铃酸肾病”（aristolochic acid nephropathy，ANN）；,我国应用较多的马兜铃属药材有马兜铃（北马兜铃的果实）、青木香（马兜铃的根部）、天仙藤（马兜铃的茎）、关木通（木通马兜铃）、寻骨风（锦毛马兜铃）、细辛、广防己（木防己）和朱砂莲等,内源性有害物质的检测方法,高效液相色谱法（HPLC)高效毛细管电泳(HPCE)色谱-质谱联用技术(GC-MS),关木通中马兜铃酸类成分高效液相色谱分析,对照品：马兜铃酸(aristolochic acid I)和马兜铃酸(aristolochic acid)；色谱柱：Symmetry C18(1504.6 mm，Wa
4、ters)；柱温：35C；流动相：1%醋酸-甲醇(1:1)；流速：1.0ml/min；检测波长：250nm。,关木通甲醇提取物的高效液相色谱图,生药中主要的内源性有害物质限量,1、有毒成分，但不是有效成分德国卫生部规定，内服含HPAs的植物药制剂，每天摄取量不得超过1 g，外用时，每天摄取量不得超过100 g 2010版药典：千里光含阿多尼弗林碱不得超过0.004%，药材最大用量每天不得超过30g2、既是有毒成分，又是有效成分2010版药典：川乌中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的总量应为0.05-0.17%。,生药中重金属(heavy metals)及有害元素(hazardous elements
5、),主要有砷、汞、铅、镉、铜、铝等；与其生长的环境条件如土壤、大气、水、化肥、农药的施用等有关；植物本身的遗传特性和对该类元素的富集能力等有关,生药中重金属和有害元素的检测方法,砷 古蔡法或二乙基二硫代氨基甲酸银法测定重金属总量：硫代乙酰胺或硫化钠显色反应比色法测定单个重金属：铅、镉、砷、汞、铜 原子吸收光谱法(atomic absorption spectrophotometry,AAS)电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS),原子吸收分光光度计由光源、原子化器、分光器、检测系统等几部分组成。,光源空心
6、阴极灯,光源的要求:窄、强、稳、小、低、纯、长、调空心阴极灯的结构与工作原理,由雾化器和燃烧器构成按燃烧器的结构可分为全耗型和预混合型两类 优点：重现性好，易于操作缺点：原子化效率低，灵敏度低,火焰原子化装置,火焰原子化器,几种常用火焰,无火焰原子化装置,石墨炉原子化器的结构,石墨炉原子化步骤,特 点优点：灵敏度高3-4个数量级，样品用量少，可测元素多缺点：共存化合物干扰大，重现性、准确度比火焰法差,低温原子化方式,低温原子化是利用某些元素（如Hg）本身或元素的氢化物（如AsH3）在低温下的易挥发性，将其导入气体流动吸收池内进行原子化。目前通过该原子化方式测定的元素有Hg，As，Sb，Se，S
7、n，Bi，Ge，Pb，Te等。生成氢化物是一个氧化还原过程，所生成的氢化物是共价分子型化合物，沸点低，易挥发分离分解。低温原子化法：测汞氢化物原子化法：测As,Sb等,光学系统,通带宽度（带宽）W：W=D*S*10-3S：狭缝宽度，D：光栅的线色散率的倒数狭缝宽度对分析结果的影响,检测系统,光电倍增管,光阴极,定量分析方法,1.标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准试样，由低到高依次分析，将获得的吸光度A数据对应于浓度作标准曲线，在相同条件下测定试样的吸光度A数据，在标准曲线上查出对应的浓度值；,或由标准试样数据获得线性方程，将测定试样的吸光度A数据带入计算。注意在高浓度时，标准曲线易发生弯曲，
8、压力变宽影响所致,2.标准加入法,取若干份体积相同的试液（cX），依次按比例加入不同量的待测物的标准溶液（cO），定容后浓度依次为：cX，cX+cO，cX+2cO，cX+3cO，cX+4 cO 分别测得吸光度为：AX，A1，A2，A3，A4。以A对浓度c做图得一直线，图中cX点即待测溶液浓度。,该法可消除基体干扰；不能消除背景干扰；,电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）是以等离子体为离子源的一种质谱型元素分析方法。主要用于进行多种元素的同时测定，并可与其他色谱分离技术联用，进行元素价态分析。测定时样品由载气（氩气）引入雾化系统进行雾化后，以气溶胶形式进入等离子体中心区，在高温和惰性气氛中被去
9、溶剂化、汽化解离和电离，转化成带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离，根据元素质谱峰强度测定样品中相应元素的含量。本法具有很高的灵敏度，适用于各类药品中从痕量到微量的元素分析，尤其是痕量重金属元素的测定。,电感耦合等离子体质谱法ICP-MS,电感耦合等离子体质谱法ICP-MS,1、对仪器的一般要求 电感耦合等离子体质谱仪由样品引入系统、电感耦合等离子体(ICP)离子源、接口、离子透镜系统、四极杆质量分析器、检测器等构成，其他支持系统有真空系统、冷却系统，气体控制系统，计算机控制及数据处理系统等。,载 气：氩气（argon，Ar），纯度应大于99.99%。进样系统：
10、按样品状态不同可以分为液体或固体进样，通常采用液体进样方式。样品引入系统由两个主要部分组成：样品提升部分和雾化部分。雾化室应保持稳定的低温环境，并应经常清洗。,离子源和采样锥：炬管和采样锥应经常清洗，实验中保持气体管路密闭不漏气。质量分析检测器 通常为四极杆分析器，可以实现质谱扫描功能。,测定法 对待测元素，目标同位素的选择一般需根据待测样品基体中可能出现的干扰情况，选取干扰少，丰度较高的同位素进行测定；有些同位素需采用干扰方程校正；对于干扰不确定的情况亦可选择多个同位素测定，以便比较。常用测定方法包括：（1）标准曲线法（2）标准加入法,中国药典（2010年版）生药或提取物重金属或有害元素的限
11、量（百万分之一）,生药中常见重金属和有害元素的限量,生药中农药残留(pesticide residues),有机氯化合物有机磷化合物 拟除虫菊酯种植、采收、包装运输、贮藏等各个环节都有可能和农药接触，被其污染,有机氯类农药残留量测定,弹性石英毛细管柱（30m0.32mm，0.25m）SE-54(或DB-1701)，53Ni-ECD电子捕获检测器。进样品温度230，检测器温度300，不分流进样。程序升温：初始100，每分钟10升至220，每分钟8升至250，保持10分钟；六六六（BHC）（-BHC，-BHC，-BHC，-BHC）、滴滴涕（DDT）（PP-DDE，PP-DDD,OP-DDT，PP-
12、DDT）及五氯硝基苯（PCNB）,GC 法,有机磷类农药残留量测定,弹性石英毛细管柱（30m0.25mm0.25m）DB-17MS(或HP-5)，氮磷检测器（NPD）。进样口温度220，检测器温度300，不分流进样。程序升温：初始120，每分钟10升至200，每分钟5升至240，保持2分钟，每分钟20升至270，保持0.5分钟。对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷农药,GC 法,拟除虫菊酯类农药残留量测定,弹性石英毛细管柱（30m0.32mm0.25m）SE-54(或DB-5)，63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度270
13、，检测器温度330。分流比201；51（或根据仪器设置选择最佳的分流比）。程序升温：初始160，保持1分钟，每分钟10升至278，保持0.5分钟，每分钟1升至290，保持5分钟。氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯,GC 法,生药中农药残留的限量,中国药典（2010年版）对药材中有机氯农药残留的限量（mg/Kg）,商务部于2005年分布了药用植物及制剂进出口绿色行业标准（WM/T2-2004)，规定农残为：六六六（BHC)0.1mg/kg,滴滴涕(DDT)0.1mg/kg,五氯硝基苯（PCNB）0.1mg/kg,艾氏剂（aldrin）0.2mg/kg,生药中其他有害物质,黄曲霉素（Aflatoxin，AF）：致 癌 检测方法：酶联免疫吸附法（ELISA)TLC、HPLC及微柱筛选法中国药典 2010版对陈皮、大海、桃仁、酸枣仁、僵蚕提出了要求：每1000kg药材含黄曲霉素B1不得过5ug，黄曲霉素G2、G1、B2、B1总量不得过10ug。,二氧化硫（SO2）检测方法：离子色谱法、酸蒸馏碘滴定法 韩国食品医药安全厅规定了226种中药材中SO2限量标准为不得过百万分之三十。,生药中其他有害物质,
