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1、第一章蛋白质化学,一、元素组成,1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。3、定氮法测定蛋白质含量：蛋白质含量6.25样品含氮量,二、结构单位氨基酸（amino acid）,1、蛋白质的结构单位,Tyr,三、氨基酸的理化性质,1、物理性质2、两性解离等电点（isoelectric point,pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点(pI)。,(zwitterion),等电点计算侧链为非极性基团或虽为极性
2、基团但不解离的氨基酸：pI=(pK1+pK2)酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=(pK1+pKR)碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=(pK2+pKR),带电状态判定 pI-pH0.带正电 pI-pH0.不带电,等电点的计算,3、紫外吸收：,Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应5.二硝基氟苯：黄色，肽链末端分析,应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与-DNP氨基酸区分和分离首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A
3、.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,Sanger试剂,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应6.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,Edman试剂,显色反应：茚三酮反应:氨基羧基同时参加反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,显色反应：茚三酮反应,茚三酮反应:脯氨酸，羟
4、脯氨酸，黄色物质,例外：Pro黄色；Asn棕色,第四节蛋白质的分子结构,二、蛋白质结构中的化学键,1.肽键 peptide bond（化学键）2.二硫键 disuffide bond（化学键）不同肽链，同一肽链不同部位半胱氨酸稳定共价键、稳定肽链空间结构破坏，蛋白质活性丧失。角蛋白,二、蛋白质结构中的化学键,3.酯键 ester bond（化学键）丝氨酸、苏氨酸羟基与氨基酸的羧基磷蛋白：丝氨酸、苏氨酸羟基维系蛋白质结构，行使功能4.离子键 ionic bond（库伦作用）相反电荷的基团碱性氨基酸，生理条件下高浓度盐、过高过低PH羧基PK低，氨基PK高，1-2个PH单位,二、蛋白质结构中的化学键
5、,5.配位键 dative bond（共价键）金属离子：Fe,Cu,Mn,Zn高级结构：锌指结构螯合剂，蛋白质解离成亚基，变形失活6.氢键 hydrogen bond氢原子与两个电负性强的原子（F,O,N）弱键，供体原子、氢、受体原子处在一条直线氢供体：=NH,-OH,-NH2,-NH3+,-CONH2氢受体：-COO-,C=O,二、蛋白质结构中的化学键,7.范德华作用力 原子、基团、分子之间弱相互作用非专一性的吸引力取向力、诱导力，色散力与距离6次方成反比，吸引不相碰蛋白质内部非极性结构，维系蛋白质高级结构8.疏水作用hydrophobic bond非极性侧链（疏水基团）在极性溶剂中为了避开
6、水相互彼此靠近所产生的作用力本质范德华作用力蛋白质的内部结构中,次级键介导蛋白质高级结构形成,（一）、蛋白质的基本结构形式,1、连接方式：肽键肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（CONH）肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（CCONHC）,2、肽分类、命名,三、二级结构,蛋白质的二级结构是指多肽链骨架原子的相对空间位置，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。,1、-螺旋(-helix)右
7、手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm；每个肽键N-H与第四个肽键的羰基形成氢键氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长轴；侧链伸出螺旋SN：S为螺旋每圈的残基数，N是形成氢键O与N原子间在主链上的原子数3.613,2、-折叠(-pleated sheet)氢键维系：氢键的方向垂直长轴；不同肽链、同一肽链不同肽段，所有肽键参与可有顺平行片层和反平行片层结构。,3、其它（1）肽链主链出现的180回折部分称-转角。由4个连续氨基酸组成，第一个残基的CO与第四个氨基酸的NH形成氢键。甘氨酸和脯氨酸-转角在球蛋白中大量存在，约占全部残基的1/4,3、其它（2）蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分
8、肽链构象称为无规卷曲。,四、超二级结构、域结构,1、超二级结构(supersecondary structure),（1）基序或模序（motifs or modules，模体符）在一些具有特殊功能的球状蛋白质中，由若干个相邻的二级结构单元按照一定规律有规则地组合在一起，相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位称超二级结构或模序。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。,2、域结构（domain，结构域）,域结构是在较大的蛋白质分子中，一条长的多肽链有时要先分别折叠成几个相对独立的区域，在组装成球状或颗粒状的三级结构。这种自二级或超二级结构
9、基础上形成的特定区域，称为结构域。短的多肽如果只有1个结构域，结构域与三级结构为同一结构层次较大蛋白质有多个结构域,五、三级结构,蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。是由不同区段上R基相互作用形成的空间构象。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。,长度缩短：球形、椭球形、杆状，等多数同时含有-螺旋和-折叠氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）次级键维系：疏水键功能区：表面或特定部位,蛋白质分子中各个亚基的三维空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构,亚基(subunit)：寡聚蛋白
10、中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基可以相同或不同。亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力亚基可以相同或不同亚基不一定只有一条链（胰岛素中A链与B链，二硫键连接),六、四级结构,第四节蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。,1、一级结构中的保守序列决定空间结构（1）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构【经典举例】蛋白变性与复性,一、一级结构与功能的关系,1、一级结构中的保守序列决定空间结构（2）不
11、同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能,一、一级结构与功能的关系,1、一级结构中的保守序列决定空间结构（3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变【经典举例】分子病,一、一级结构与功能的关系,1、空间结构体现生物特异性2、空间结构体现生物活性3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性,二、空间结构与功能的关系,空间结构中的特定区域体现生物活性,肌红蛋白与血红蛋白,别构效应（别位效应、变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构
12、效应。包括正协同、负协同效应【经典举例】血红蛋白（Hb）：由22四聚体组成，每个亚基含有1个血红素辅基；Hb的氧解离曲线呈“S”型。多种空间构象，多种活性状态,第五节蛋白质的理化性质及分离纯化,1、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离”2、紫外吸收：最大吸收波长280nm 3、胶体性质：不能透过半透膜,4、沉淀、凝固5、蛋白质变性,蛋白质在溶液中维持稳定的因素：表面电荷、水化层（溶剂化层）变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性,蛋白质的理化性质,（1）变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。理化性质的变
13、化：紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。,5、变性(denaturation)、复性(renaturation),蛋白质的变性作用：（1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出（2）结絮：变性蛋白质不一定发生沉淀，因为电荷稳定因素未被破坏，当调节PH到等电点，立即结成絮状不溶物的现象。絮状沉淀可溶于强酸、强碱（3）凝固：絮状沉淀如加热，则变成坚固的凝块，不能再溶于强酸、强碱的现象,二、蛋白质的分离纯化（一）根据分子大小不同的分离方法1.透析：蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放在蒸馏水中，蛋白质溶液中无机盐小分子通过透析袋扩散入纯水中,二、蛋白质的分离纯化（一）根据分
14、子大小不同的分离方法2.超过滤：利用外压或离心力使水和其他小分子通过半透膜，蛋白质留在膜上,二、蛋白质的分离纯化（一）根据分子大小不同的分离方法3.密度梯度离心,二、蛋白质的分离纯化（一）根据分子大小不同的分离方法4.凝胶过滤,二、蛋白质的分离纯化（二）根据溶解度差异的分离方法1.等电点沉淀法蛋白质在等电点时净电荷为零分子间的静电斥力减少容易聚集而沉淀溶解度最小,2.,二、蛋白质的分离纯化（二）根据溶解度差异的分离方法,二、蛋白质的分离纯化（三）根据电荷不同的分离方法,二、蛋白质的分离纯化（五）亲和层析,重要内容：1、重要名词：isoelectric point；motifs；domain;subunit；allosteric effect;protein denaturation;molecular disease2、结构层次元素组成：C、H、O、N（16%）、S结构单位：20种L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等）一级结构：肽键；多肽链；N端C端二级结构：稳定力（氢键）；类型（螺旋，折叠，转角，无规卷曲）三级结构特点四级结构特点3、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性4、分离纯化：超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛5、结构与功能关系（举例）,
