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1、肿瘤标志物检测方法,一 概述,同一个标志物可以用不同的方法检测，如可以从血清水平、免疫组化水平检测CEA和Pgp等，也可以从细胞和分子水平用FCM和RT-PCR来检测。,二 血清学水平,血清学水平：除了传统的放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析（ELISA)外。目前在国内主要有三类全自动免疫化学分析系统（化学免疫发光免疫分析系统、荧光免疫分析系统和电化学发光免疫分析系统）广泛的应用于临床，对血清肿瘤标记物检测具有快速、准确、半定量。可检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f-PSA等。,1 放射免疫分析（一）,放射免疫分析
2、（radio immunoassay,RIA）放射免疫分析自20世纪60年代问世以来，在生物医学各个领域得到了广泛的应用。20世纪90年代，RIA技术研究的主要进展是试管固相法。学者将试管固相法称之为第四代RIA。,固相RIA和免疫放射测量法（IRMA）的灵敏度、特异性、稳定性及测量范围均优于液相竞争法；尤其是不需要使用离心机进行分离，简化了操作步骤，提高了检测的精密度；活化试管RIA和IRMA技术系共价键结合，包被均一，稳定性好，实现了分析技术一步法，易于实现自动化分析。,1 放射免疫分析（二）,2 酶免疫分析（一）,酶免疫分析（enzyme immunoassay,EIA）由于RIA和IR
3、MA有着自身固有的、难以克服的缺陷，Engvall和Vanweemen各自领导的研究小组分别以酶代替同位素，于1971年创立了酶免疫分析技术(EIA)。因其标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，EIA技术得到了迅速的普及和发展。20世纪90年代后期，在EIA中引进了放大系统，主要是生物素亲和素系统的应用，使测定的灵敏度赶上或超过了RIA。,酶联免疫荧光测量法（ELIFA）同时兼具酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光免疫分析（FIA）两种方法的优点，其灵敏度较传统的ELISA明显提高，最小检出值达10-15mol/L。增强发光酶免疫分析法（ELEIA）是20世纪80年代后期发展起来的新型
4、免疫分析技术，其特点是：酶促增强发光信号，且发光信号保持稳定，该方法的最小检出值达10-20mol/L。,2 酶免疫分析（二）,3 化学发光免疫分析（一）,化学发光免疫分析（chemiluminesent immunoassay,CLIA）1981年，Pannagli将化学发光原理与免疫反应结合起来建立了化学发光免疫分析法（CLIA）。这种方法虽然灵敏度可以达到放免的水平，但是影响检测结果的因素较多，稳定性较差，而且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。使用甲基吖啶酯标记抗体更为理想，因不必加催化剂，所以受外界因素的干扰少，且操作简单，稳定性高，标记蛋白后不影响发光信号的产生。在这一领域全自
5、动测定仪器的研制发展很快，极大地提高了该方法的分析效率和普及推广。,近年来，免疫电化学发光（IECL）技术正在快速发展。这一方法具有灵敏、快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、方法灵活多样的优点。它是集电化学发光、生物素抗生物素、免疫分析，并由固相免疫分析发展起来的磁微球等技术于一体，是众多学科交叉的研究领域。IECL分析方法多样，广泛地应用于抗原、半抗原和抗体的免疫检测，其线性范围也较宽，符合临床检验的需要。IECL技术的发展趋势在于合成新的发光标记物，优化标记技术和免疫分析方法。,3 化学发光免疫分析（二）,4 时间分辨荧光免疫分析（一）,时间分辨荧光免疫分析（time resolve
6、d fluorecence immunoassay,TRFIA）是20世纪80年代初问世的另一种非放射性免疫分析法,其主要特点是示踪物为标记稀土元素,如Eu3、Tb3或Sm3。TRFIA灵敏度高、应用范围广，目前已实现分析技术完全自动化。,运用Eu3标记物重组G 蛋白作为通用示踪物极大地提高了标记化合物的质量，有利于降低非特异性结合。提高半抗原标记率将方法的灵敏度提高到一个新水平，以适应生物样品中浓度很低的物质的测定。一种将半抗原和聚赖氨酸结合作为标记Eu3的前体；一种将链亲和素与甲状腺素球蛋白结合作为标记Eu3的前体。利用这两种人工合成的标记前体制备的Eu3标记物，将方法的灵敏度提高了12
7、个数量级。,4 时间分辨荧光免疫分析（二）,五 电镜水平,电镜水平：电镜酶细胞化学水平技术、免疫电镜技术、原位杂交电镜技术。,三 组织化学水平,组织化学：免疫组化和原位分子杂交组化技术是今年发展起来的一门边缘学科。它将免疫学技术和分子生物学技术同组织病理学切片方法巧妙结合在一起，在组织细胞原位显示某些化学成分和特定基因片断。,常规标本中约515疑难病例和恶性肿瘤需采用免疫组化进行鉴别诊断和预后分析。Porter D利用mRNA原位杂交检测细胞水平基因表达，在组织芯片上免疫组织化学检测乳房导管原位癌和浸润癌病理学特征和临床意义。图像分析技术可以定量测定组织切片上肿瘤细胞DNA量和形态学分析，对判
8、断肿瘤恶性程度及预后具有重要临床价值。,三 组织化学水平,四 细胞水平,细胞水平：流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）。利用FCM对细胞、细胞器的结构和某些功能进行定量检测；利用细胞表面特征性标记对特定的细胞亚群进行分析和分选的先进技术方法。利用FCM检测白血病和淋巴瘤标记物（CD系列）利于诊断和鉴别诊断；利用FCM检测恶性肿瘤细胞的P-gp，可为临床选择化疗药物提供依据；利用FCM检测消化道肿瘤外周血CD44水平。,六 分子水平,分子学水平：聚合酶链反应法（PCR）是一种极为简单、敏感、高效、特异和快速的能在体外扩增DNA的技术。国内外用RT-PCR方法检测外周血中的肿瘤细胞的
9、主要标记基因有细胞角蛋白19（CK19 mRNA）和20（CK20 mRNA）用于上皮性恶性肿瘤；癌胚抗原（CEA mRNA）用于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等CEA分泌性肿瘤；甲胎蛋白（AFP mRNA）用于肝细胞癌微转移的检测。,七 生物芯片水平,基因芯片：Zhu G报道用显微分割和芯片技术结合分析乳房癌不同部位肿瘤细胞之间基因表达差异；组织芯片：组织芯片可以帮助节省试剂、人力和费用。过去分析一个肿瘤的试剂量现在可以分析高达数百甚至上千个肿瘤，而且是在同一张切片上同时进行；蛋白芯片：为多标志联合检测提供了理想工具，英国RANDOX公司已经在全球同时推出的包括8种肿瘤标志的蛋白芯片。,八
10、表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（一）,表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）：是近几年新兴的差异蛋白质组学技术，具有快速、准确、高通量、灵敏度高等特点，为蛋白质研究提供了一项有效技术，加快了肿瘤标记物的筛选和研究。SELDI-TOF-MS由蛋白质芯片、飞行质谱和分析软件部分组成。,生物样品（如血清、细胞）,吸附到芯片上,特异性结合的蛋白质,能量吸收分子,结合的蛋白质解析形成荷电离子（、）,肿瘤标记物,软件分析,质谱图,特定蛋白质被特定的芯片表面,洗脱,非特异性结合的蛋白质,八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（二）基本工作原理,缺陷及进一步改进：SELDI-TOF-MS自身也存在一定的缺陷，需要进一步的完善，如应保证操作平台的稳定性，可设计相应的蛋白芯片试剂盒，降低耗材成本，便于推广。,八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（三）,
