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1、代谢组在糖尿病肾脏病诊治及发病机制中的研究进展2023摘要糖尿病肾脏病(DKD)已逐渐成为我国慢性肾脏病的主要病因。由于缺乏特异性治疗措施，一旦出现大量蛋白尿和肾功能不全，往往不可逆地进展至终末期肾衰竭，如何早期诊治DKD成为近年来的研究热点。代谢组技术能够高通量地定量检测多种代谢物，进而通过分析代谢途径解析疾病的发生发展机制，因而广泛应用于糖尿病、心血管疾病、肾脏病、肿瘤等慢性非传染性疾病。既往研究发现多种代谢物与DKD之间存在相关关系，可能成为潜在的生物标志物；与此同时，代谢物也参与糖尿病造成的肾脏损伤，丰富了DKD发病机制的认识。该文对代谢组在DKD诊治及发病机制中的研究进展进行综述。当
2、今社会，各种慢性非传染性疾病正日益成为困扰全世界的健康难题。大样本队列的代谢组学研究表明，数百种代谢物与2型糖尿病(type2diabetesmellituszT2DM)1】、肾脏病、心血管疾病等密切相关，提示代谢可能是上述疾病的主要原因和共同机制。代谢物的水平是基于基因的蛋白质表达水平及其酶促活性的实时动态反映，当基因中的单个脱氧核糖核酸碱基变化时，往往导致内源性代谢物水平发生多达10000倍的改变。与此同时，代谢物还受到外源性因素影响，如饮食、生活方式、运动、肠道菌群、环境污染等。因此，代谢组整合了包括基因组、转录组、蛋白质组、酶，以及外源性暴露因素等丰富多样的信息，被称为后基因时代最接近
3、于表型的组学2o糖尿病肾脏病(diabeteskidneydisease,DKD)已成为我国终末期肾脏病的主要病因。研究发现，代谢物的改变与DKD关系密切，不仅成为其生物标志物，而且直接参与肾组织病变的发生发展。本文将对代谢组学在DKD诊治及发病机制中的研究进展进行综述。一、代谢组的研究方法概述根据研究目的和检测代谢物的种类，代谢组分为非靶向代谢组和靶向代谢组。前者能够无差别地检测、识别并量化生物样品中尽可能多的代谢物，由于检测信号覆盖宽泛，导致对未知化合物的注释面临巨大挑战。后者对结构相似或属于某一条或几条相关代谢途径的一种或多种特定代谢物进行检测分析，即对种类有限的代谢物进行绝对定量。与仅
4、包含4个核苜酸碱基的基因组、由20种氨基酸组成的蛋白组相比，代谢组的体量巨大，包含数千种不同类别、不同化学特性的化合物。目前尚缺乏足以量化整个代谢组的检测平台。核磁共振波谱法(nuclearmagneticresonance,NMR)和质谱法(massspectrometry,MS)是最常用的代谢组技术，后者按照分离技术的不同，又分为气相色谱-质谱联用技术(gaschromatographymassspectrometryzGC-MS)和液相色谱-质谱联用技术(liquidchromatographmassspectrometryzLC-MS)oNMR借助原子核的自旋特性，记录其在核外磁场中吸
5、收射频辐射而产生的能级跃迁。该技术几乎不需要样品制备、色谱分离或化学衍生化等预处理，不仅具备非侵入性、自动化、可重复性，而且尤其适用于检测与蛋白质结合的代谢物，在评估活体组织代谢物(如活细胞实时代谢通量分析)中的应用几乎无可替代。NMR大都应用于样本量较大的代谢组研究。然而，其检测范围仅在每升微摩尔到毫摩尔范围内，因而灵敏度相对较低，不足MS的1100110.MS具备高分辨率、高灵敏度特性，是应用最广泛的代谢组研究平台。化合物首先通过气相/液相色谱技术进行分离以减少离子抑制，随后利用质谱仪进行鉴定和定量。GC-MS更适用于分离挥发性和热稳定的代谢物，以及通过衍生化使之具备挥发性的代谢物。LC-
6、MS具有较GC-MS更高的灵敏度，可用于分析不稳定、难挥发及分子量较大的代谢物。与NMR相比，由于化学衍生化可能会改变物质结构，加之样品制备过程中发生的不可预测变化等MS技术的固有属性，不可避免地造成对检测样本的破坏，这也是其结果可重复性差的主要原因。二、代谢组在DKD诊治中的应用我国拥有近1.3亿的糖尿病人群，90%以上为T2DM,其中20%40%合并DKD,尽管目前筛查仍主要依据尿白蛋白/肌酊比值(urinaryalbumintocreatinineratio,UACR)和(或)估算的肾小球滤过率(estimatedglomerularfiltrationrate,eGFR)【31，但UA
7、CR与肾脏病变程度不平行，30%51%的T2DM随着疾病的进展UACR却在下降，甚至有20%40%的糖尿病患者从未出现尿蛋白4。eGFR作为衡量肾脏结局的指标，也不能用于早期预测DKD的发生发展。此外，白蛋白和肌酊的准确性往往受多种因素干扰。肿瘤坏死因子受体、成纤维细胞生长因子23、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(solubleurokinaseplasminogenactivatorreceptorzsuPAR)等新型标志物的临床效能和特异性还有待验证。1 .代谢组与DKD的诊断：代谢组在DKD诊治中的应用始于10余年前在纳入1型糖尿痼type1diabetesmellitus,T1DM)
8、患者的芬兰糖尿病肾病(Finnishdiabeticnephropathy,FinnDiane)研究中,通过NMR发现血清鞘磷脂与基线UACR增多有关2。o在合并肾损害eGFR60mlmin-1(1.73m2尸厢单纯T1DM或T2DM患者的尿液中zGC-MS检测到的差异代谢物大都是水溶性的有机离子，主要定位于线粒体，来源于氨基酸代谢和三竣酸循环，这与线粒体代谢在DKD中的作用不谋而合5o用LC-MS在血浆中检测到肠道菌群来源的代谢物苯基硫酸盐，不仅与T2DM患者的UACR有关,还能反映微量白蛋白尿患者2年内UACR的增高程度，预测效能优于suPAR(141oLC-MS的结果表明，T1DM患者血
9、浆中的瓜氨酸等代谢物与大量白蛋白尿有关17。对LC-MS靶向定量检测到的单纯T2DM和T2DM合并DKD的差异代谢物进行通路分析表明，变化最显著的14条通路中，有10条涉及氨基酸代谢，2条为脂代谢12。在包含单纯T2DM、DKD和慢性肾脏病(chronickidneydisease,CKD)的研究对象中，采用人工智能从71项临床指标、13231种代谢物、180种脂质以及近4万个单核昔酸多态性中筛选出27种代谢物、2个临床指标(年龄、体重指数)和4个单核苗酸多态性,用上述33个特征项的组合指标诊断DKD的准确性和特异性分别达到79.2%和81.0%o有趣的是，综合两个具有特定相互作用的特征较单一
10、特征显著增强了模型的鉴别效能【91类似地，将异戊酸等7种尿液差异性代谢物进行组合后，较任何单一代谢物在诊断T2DM合并DKD中表现出更高的应用价值【12。2 .代谢组预测DKD的进展:利用JoSiin肾脏队列(JoslinKidneyStudy)的T2DM人群进行配对研究，采用LC/GC-MS检测血浆差异代谢物，比较不合并肾脏病的糖尿病与发生终末期肾脏病的进展性DKD,结果表明，亮氨酸等氨基酸及其衍生物，P-硫酸甲酚等水溶性尿毒素与ESKD有关【7】。LC/GC-MS靶向代谢组学分析T1DM和T2DM患者的尿液,结果与动物模型肾组织的转录组学相吻合,即DKD与对照之间存在显著性差异的代谢物主要
11、富集在脂肪酸、葡萄糖、氨基酸代谢和三竣酸循环。与单纯糖尿病相比，尿液中基线时显著性增高的柠檬酸等三竣酸循环中间产物能够预测DKD的发生eGFR65mlmin-1(1.73m2)第。TlDM合并CKD3期的前瞻性队列研究采用LC/GC-MS检测血清标本结果表明在eGFR下降最快的1/3的研究对象中假尿苗等显著性差异的代谢物具有预测ESKD的价值；不仅如此，代谢物与肾小管损伤指标之间的正相关关系，使之在DKD预后中的应用更加令人信服【I。FinnDiane研究中，eGFR下降最快的25%的研究对象的血清鞘磷脂水平在基线时就已经显著降低；校正吸烟、血脂、血糖等风险因素后，血清鞘磷脂仍能预测大量蛋白尿
12、的DKD患者发生ESKD的风险21L采用NMR技术分析上述人群尿液中的51种代谢物，发现支链氨基酸等与UACR分级增高、eGFR下降、ESKD等DKD的进展指标密切相关8。在评估T1DM和T2DM患者的肾脏结局中，研究者比较了基于LC-MS的非靶向代谢组与年龄等13项基线临床指标，发现尿液3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羟基异丁酸、柠檬酸和顺乌头酸显现出优于临床指标的预测效能【11】O在包含eGFR60mlmi-i(1.73)-1人群的T2DM队列中，研究者采用LC-MS发现基线的血清己酰肉碱、色氨酸和犬尿氨酸水平不仅是死亡的独立危险因素，还能够优化现有的死亡风险预测模型【19】。近年来,人们尝试利
13、用代谢组解释DKD的进展轨迹4。在一项探索T2DM患者生物标志物的前瞻性队列中，研究者根据患者肾功能下降情况，将其分为稳定组和快速进展组，eGFR的年平均变化分别为0.1mlmirH(1.73r2)7和-6.75mlmirH(1.73m2)-1o结果表明，临床指标、蛋白组、代谢组(LC-MS)、脂质组，以及综合上述数据的多维度指标【23，在预测DKD进展轨迹中均具有一定的应用价值。遗憾的是，该研究结论并不支持代谢组学更具优势。然而，为期35个月的研究周期较短、代谢标志物的检测及筛选方法依据不充分、研究对象存在复杂的合并症/并发症以及DKD快速进展的标准设定等试验设计上的缺陷问题，均可能对研究结
14、论造成影响，因而仍有待改进。3.代谢组与DKD的治疗：研究显示,T2DM患者在钠-葡萄糖共转运蛋白2(SodiUm-glucosecotransporter2,SGLT2)抑制剂治疗仅6周后，LC-MS分析就显示,尿液中与线粒体代谢相关的9种代谢物的含量发生显著性改变6o类似的研究亦显示，T2DM患者在SGLT2抑制剂治疗12周后，采用LC-MS检测血浆代谢物，发现108种发生显著性改变，主要涉及甘氨酸降解、三竣酸循环、L-肉碱生物合成及瓜氨酸代谢【18L血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素口受体拮抗剂治疗也改变了T1DM或T2DM合并DKD患者尿液中柠檬酸、延胡索酸等的含量16。采用NMR比较
15、T2DM患者在接受代谢手术联合药物治疗与单纯药物治疗6个月后尿液代谢物的变化。结果表明，尽管两种治疗手段均能降低尿糖排泄，但仅联合治疗组患者的尿代谢组在治疗后发生特征性的显著变化，表现为精氨酸等增加的同时，苯丙氨酸等代谢物的减少。不仅如此,上述代谢改变与患者2年后的白蛋白尿的缓解密切相关11。值得注意的是，依据LC-MS检测出的尿液中18种代谢物构建的代谢物分数，能够预测盐皮质激素受体拮抗剂缓解T2DM患者白蛋白尿的疗效13由此可见，代谢物有望成为评估临床疗效的新指标。三、代谢物调控DKD发生发展的研究进展尽管代谢物与DKD进展的关联证据已非常充分，但观察性数据的证据级别仍然偏低。病变状态下，
16、发生改变的多种代谢物之间是否存在内在关联、代谢物是否直接参与调控DKD的进展仍不清楚。2018年，Tanaka等【24】首次利用空间代谢组描绘出糖尿病模型中三竣酸循环中间产物蓄积的问题，为DKD肾组织本身的代谢改变提供实验依据。还原型辅酶口氧化酶4通过延胡索酸水化酶调节三竣酸循环中间产物延胡索酸，促进缺氧诱导因子-1讨口转化生长因子-的表达，引发内质网应激、基质沉积和肾小球损害25。糖尿病肾组织中葡萄糖及脂肪酸代谢流的增强与蛋白乙酰化及线粒体功能障碍有关16。在TlDM或T2DM,CKD3b期的研究对象中，同时采用蛋白组学和代谢组学（LC-MS）分析表明，血浆差异性代谢物富集在糖酵解、三竣酸循
17、环和瞟吟代谢通路26,糖酵解代谢途径的关键酶丙酮酸激酶亚型2在DKD患者的血浆和肾组织中27呈现一致性改变。动物实验表明，丙酮酸激酶亚型2介导足细胞自身的能量代谢及其与内皮细胞的相互作用，是调控糖尿病肾小球结构和功能的关键因子27,28瓜氨酸、犬尿氨酸及色氨酸是3种在体内存在转化关系的氨基酸。研究表明，在系统性炎症引发的糖尿病死亡结局中，色氨酸/犬尿氨酸转化率的中介作用高达43%19,为代谢和炎症机制共同参与调节糖尿病的死亡结局提供了临床证据。事实上，犬尿氨酸的增高部分由于肾脏排泄减少所致，也与糖尿病促炎症状态下引发的免疫细胞将色氨酸转化为犬尿氨酸有关，从而加剧了犬尿氨酸的蓄积。DKD患者血中
18、非对称二甲基精氨酸和瓜氨酸水平的升高与肝脏中尿素循环和精氨酸代谢受损有关。非对称二甲基精氨酸的积累进而导致肾功能障碍，高水平的瓜氨酸还与心功能障碍有关。巨噬细胞犬尿氨酸途径异常制约内源性烟酰胺腺噤吟二核苜酸的从头合成，继而引发促炎/抑炎平衡失调的致病机制在DKD中可能同样存在。溶血磷脂酰胆碱（Iysophosphatidylcholine,LPC）家族的溶：0和18：0在人群中检出率最高。采用LC-MS分析T2DM合并DKD（CKD3期思者尿液中的LPC发现与eGFR的快速下解每年下降率-10%）有关；空间代谢组表明，DKD模型的肾小管间质中增多的LPC引发线粒体损伤、内质网应激和细胞凋亡22
19、肠道细菌特异性的酪氨酸酚裂解酶催化酪氨酸生成的苯酚，在肝脏中转化为苯基硫酸盐，是造成DKD足细胞损伤、基底膜增厚和蛋白尿的致病性代谢物W。四.代谢组的应用前景和挑战生命的任何过程都与代谢密不可分，因此代谢组天生就具有极高的价值。相关的研究已经横跨代谢分子-细胞及亚细胞结构-组织器官稳态-人群疾病4个层面2。代谢组技术在DKD等疾病领域的临床应用可能面临几个共性问题X1M弋谢是一个动态变化稍纵即逝的过程，其准确性和可重复性如何保证。（2）作为一种对检测技术和后期分析高度依赖的方法学，代谢组学尽管十分先进，但仍亟待发展和更新。此外，代谢组通常基于已知代谢物结构进行非靶向或靶向检测，然而大量现阶段未
20、知代谢物的结构尚未阐明，成为制约该技术发展的瓶颈。(3)作为疾病标志物的研究，仍需要阐明代谢物在DKD中的功能及病理意义，才能更具有临床推广和转化价值。(4)代谢物往往反映肾小球、肾小管中代谢和内分泌功能的下降，与其他病因的CKD十分类似，尤其是随着肾脏损伤的慢性化进展，无论是作为生物标志物，还是致病因子，代谢物均逐渐丧失了对DKD的特异性。在今后的研究中，以代谢组、蛋白质组、基因组等多组学数据为基础，结合文本、临床指标等非图像的医学数据源，通过非监督学习或半监督学习，从不依赖于标记甚至不完善的数据中获得学习见解的新型医学人工智能模式29,必将成为辅助临床诊疗的重要手段。综上，糖尿病患者一旦合并DKD,其心血管事件和死亡风险均成倍增加，持续的高糖高脂状态下，包括肾脏在内的全身重要脏器自身的代谢改变无疑是各种并发症发生发展的病理基础，也促成了代谢组技术在临床诊疗上的广泛应用。尽管已有充分的证据肯定了代谢组在DKD诊治中的价值，也指出经典和新型降血糖药物对代谢过程及代谢物的调节及相关的器官保护效应30；然而，代谢组真正应用于DKD的临床诊治仍然任重而道远。代谢组检测分析技术的更新、临床大样本的长期随访验证，以及实验室基础研究的深入开展将为代谢组应用于DKD提供重要支撑。
