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1、2024枫糖尿病患者家系基因突变分析及产前诊断摘要目的分析枫糖尿病(maplesyrupurinedisease,MSUD)患者家系基因突变情况以及对产前诊断的作用。方法2005年至2010年间,共诊断4例MSUD患儿其中男婴和女婴各2例,发病年龄分别为生后2、5、10和26d0利用聚合酶链反应技术扩增BCKDHA.BCKDHB基因外显子编码区序列,直接测序分析4例患儿BCKDHAxBCKDHB基因的突变情况。在患儿母亲再次妊娠1620周时抽取羊水细胞,对培养后的羊水细胞进行相应基因突变检测,用于产前诊断。结果4例患儿中共检测到6种不同的基因突变,包括4种新突变(c.308TCc.562GTx
2、c.1279CG、c.1280-1291del12)o其中在3个家系的BCKDHA基因上械哩!15种突变(:.3081_(：、c.562GTxc.868GAsc.1279CG及c.1280-1291del12)z一个家系在BCKDHB基因上检测到c.853CT1个突变。4例患儿母亲再次妊娠羊水细胞中均检测到1个先证者携带的突变提示胎儿为MSUD杂合子。结论通过家系BCKDHAxBCKDHB基因分析初步了解MSUD患者的基因突变情况,并成功应用于产前诊断,为MSUD家庭提供帮助。【关键词】枫糖尿病;3-甲基-2-氧代丁酸脱氢酶(硫辛酰胺);系谱;产前诊断枫糖尿病(maplesyrupurined
3、isease,MSUDzC)MIM248600)是一种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缴氨酸)代谢紊乱疾病,属于常染色体隐性遗传病,是由于支链o酸脱氢酶复合体(branched-chain-ketoaciddehydrogenaseComPleX,BCKD)活性降低导致的一种罕见疾病,其总体患病率约为1：1850001,但在门诺派教徒人群患病率较高,为1：3802o此复合体由支链Om酸脱竣酶(branchedchain-ketoaciddecarboxylase,E18、b支链酮酸脱竣B(branched-chain-ketoaciddecarboxylasezE1)和双氢脂酰转环酶(lipoa
4、te-bearingdihydrolipoyltransacylase,E2)亚单位组成,其编码基因分别为BCKDHA,BCKDHB及DBT,其中任何一个基因发生突变都会导致此病。由于BCKD酶活性降低,造成支链氨基酸和支链a酮酸积聚在体内,对脑组织产生神经毒性作用导致进行性神经退化性病变。BCKD是由ElaE2、特异性激酶和特异性磷酸酶组成的立方体结构,由6条基因的编码产物构成。根据基因突变MSUD分为Ia型(OMIM608348)(编码臼C亚基的BCKDHA基因突变)、Ib型(OMIM248611)(编码E邛亚基的BCKDHB基因突变)、II型(OMlM248610)(编码E2亚基的DBT
5、基因突变)、11I型(OMIM238331)(编码E3亚基的DLD基因突变)/V型和V型分别为特异性激酶和磷酸酶基因突变型。迄今有关BCKDHAsBCKDHBsDBT的基因突变报道已有150余种,E3基因突变报道较少。本研究4例中国MSUD患儿及其父母进行BCKDHAxBCKDHBsDBT基因突变检测,并对这4个家系进行产前诊断。资料与方法一、研究对象及诊断标准MSUD患儿4例,男2例,女2例,发病年龄分别为生后2、5、10和26d,发病日期分别为2005年3月17日、2010年8月2日、2005年10月24日、2008年6月23日。1例家系父母为近亲婚配,其余3例家系父母非近亲婚配。2例由上
6、海交通大学医学院附属新华医院诊断,2例由山东省青岛市妇女儿童医疗保健中心诊断。诊断标准:（1）发病时喂养困难、嗜睡、肌张力异常、抽搐、尿中焦糖样异味等;（2）血串联质谱检测亮氨酸（正常值50300molL）缴氨酸（正常值60250molL）增高及尿检测多种酮酸增高；基因检测发现突变位点1。这4例患儿母亲再次妊娠时,要求进行产前诊断。签署知情同意书后行家系基因突变分析和产前诊断。二、研究方法1 .外周血白细胞采集征得患儿家长同意后,取患儿及其父母外周静脉血,分离白细胞提取DNAo2 .羊水细胞采集及培养:患儿母亲再次妊娠（均是与同一配偶妊娠）1620周时经羊膜腔穿刺术抽取羊水20ml,取2ml用
7、于气相色谱质谱检测支链a三同酸,其余羊水添加培养因子及20%胎牛血清培养23周后收集细胞进行BCKDHA及BCKDHB基因突变检测。3.BCKDHAxBCKDHB基因检测:首先对患儿和其父母基因组DNA进行基因检测,然后对羊水细胞进行相应突变检测。BCKDHA基因包含9个外显子,BCKDHB基因包含10个外显子,应用Primier5.0软件参照文献3对BCKDHA基因和BCKDHB基因编码区分别设计了9对和10对引物。扩增反应体系为50上包含20Ong基因组DNA、5ldNTPs(1.25molL)1l引物(12.5molL)5lIOxTaqDNA聚合酶缓冲液、IpITaqDNA聚合酶、加灭菌
8、蒸储水至终体积50lo反应条件如下：95。C预变性1minz95oC变性30s,5660C退火30sz72oC45s进行34个循环,72。C再延伸Wmin0经纯化后进行DNA测序(ABI377测序仪,上海生工生物公司)。测序结果采用Chromas软件分析,并与GenBank人类BCKDHA基因(NMj)OO709)、BCKDHB基因(NM_000056)进行比较,突变外显子均行双向测序。结果一、临床资料4例患儿均在新生儿期发病,临床表现为经典型,主要有呕吐、嗜睡、纳差、惊厥、肌张力增高、喂养困难等症状,其中2例患儿头颅磁共振检查发现脑内广泛异常信号影。4例患儿对维生素B1治疗均无反应,只能用不
9、含亮氨酸、异亮氨酸及缴氨酸的营养粉治疗。4例患儿中1例诊断后不久未及时治疗死亡;余3例接受治疗,1例依从性较差,间断治疗，2例依从性较好，坚持治疗并定期随访。发病后随访时间16年,治疗后的3例患儿仍有智力落后、运动发育迟缓等表现,其中间断治疗的患儿智力落后更严重,表现为不会说话、运动障碍。二、BCKDHA.BCKDHB基因突变检测结果4个家系的基因突变检测结果见图1及表3。1号家系患儿仅检测到1个BCKDHA基因突变,且羊水细胞检测到1个相同的突变,未检测到其他突变;其余3个家系患者均检测到2个突变,羊水细胞均检测到1个突变。患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变,提示胎儿为
10、MSUD杂合子。家系2和3的突变均发生在BCKDHA基因上,家系4的突变发生在BCKDHB基因上。另外,2号家系患儿、父亲和胎儿携带多态性位点c.972CT(F324F)4xc.1221AG(L407L)(HGVbaSeSNPOoOOo8700)均为同义突变。讨论MSUD根据发病时间和病情进展情况可以分为5型:(1)经典型;(2)中间型;间歇型;维生素B1有效型;二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶缺乏型。本研究4例患儿均于新生儿期出现嗜睡、喂养困难、尿异味等症状,并出现惊厥、肌张力增高等神经系统症状,其中1例患儿1月龄时因难治性酸中毒死亡。综合以上特点,可明确该4例患者均为经典型。由于经典型MSUD患者新
11、生儿期常出现反应差、嗜睡等非特异性症状,因此对疑似患者应及时进行血、尿氨基酸检测以便早期诊断。本科室曾报道利用串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测诊断该病5。本研究4例患者在新生儿期即通过血串联质谱及尿气相色谱-质谱技术检测得以诊断。患儿血中亮氨酸显著增高,最高水平达正常参考值上限8倍以上;缀氨酸和亮氨酸/苯丙氨酸比值亦明显增高。尿气相色谱-质谱检测尿中通酸发现,尿中2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、乙酰乙酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-异己酸及乙酰甘氨酸均显著高于正常参考值。经典型MSUD需要早期治疗,强调诊断后立即干预,从而改善其预后。本研究中1例患者于新生儿期死亡/例患儿因家长放弃治疗,智力
12、严重落后,余2例治疗依从性较好,但仍出现智力落后、运动发育迟缓等神经系统损害表现,可能与胎儿期及新生儿期中枢神经系统受损有关。故对于新生儿期无明确原因出现神经系统异常者,需要尽快进行血串联质谱及尿气相色谱-质谱检测,以便早期诊断早期治疗。由于MSUD是致死、致残的遗传性疾病，治疗困难,且预后不良。对于有生育MSUD患儿风险的夫妇进行产前诊断,是防止MSUD患儿出生的重要手段。通过对MSUD先证者进行基因诊断,再为先证者母亲妊娠后进行产前诊断,可提高产前诊断的准确性。有关MSUD基因突变研究,目前文献已报道150余种,不同种族存在不同的热点突变。发病率最高的门诺派教徒社区最常见突变为BCKDHA
13、基因c.1312TA(p.Y393N),该突变预计携带率高达10%2;也有报道其他源自同一祖先的非门诺派教徒人群常见突变为c.1312TA(p.Y393N)7o葡萄牙报道在吉普赛社区BCKDHA基因热点突变为c.117delC(p.R40GfsX23)8o亚洲人群中,韩国报道了3例MSUD患者5个位于BCKDHA基因上的突变9;泰国有1例BCKDHA基因产前诊断的报道10,胎儿及父母携带c.529CT(p.Q177X)无义杂合突变;中国地区尚未检索到有相关突变类型和频率的报道。本报道4例患儿中的1号、2号、3号家系患者基因突变存在于BCKDHA上,确诊B为MSUDIa型,4号家系患者基因突变存
14、在于DKDHB上确诊为MSUDlb型。BCKDHA基因上常见突变c.868GA(p.G290R),初由Chuang等11报道1例轻型患者携带纯合突变(报道为p.G245R)z2006年Rodriguez-Pombo等12报道2例症状较重的间歇型携带杂合突变。本研究中1号家系携带该突变。G290-可以保证支链Cffi酸脱氢酶复合体的环状结构的紧密结合，G290-位于亚单位-表面结合袋,推测G290R突变妨碍了戈。亚单位的结合,由此导致o232亚单位之间的组装错误而引起酶活性下降12葡萄牙人群中的热点突变c.117delC(p.R40GfsX23)弓|起读码框移,在下游23个密码子处出现终止密码子
15、，形成截短蛋白,仅含61个氨基酸残基彳艮快从线粒体中被清除13。同时,由于终止密码子出现在非常靠前的位置上,所以相应的mRNA被无义介导降解清除甚至不产生截短蛋白14。本研究发现的BCKDHA基因突变中,除了c.1280-1291del12突变外,c.308TC(p.L103P)xc.562GT(p.G188W)xc.868GA(p.G290R)xc.1279CG(p.L427V)突变均为错义突变。根据E1的晶体结构,L103-可能在疏水核的临界位点,在这个位点上,4个环状结构通过疏水键结合在一起。该位点突变L103P可能打破疏水核的结构15。G188-位于亚单位结合区G188W突变可导致E1
16、亚单位组装异常从而影响酶活性。3号家系患儿的基因型为c.308TC(L103P)+562GT(G188W),出生后26d发病,临床表型为经典型,提示这2个致病突变对酶活性影响较大。c.1279CG(p.L427V)和c.1280-1291del12(p.L427LfsX20)发生在C-末端残基处,C-末端残基的突变影响亚基的正确组装和0202的自然结构形成同时,L427-他于亚单位结合区的延伸端,该延伸端对酶的催化中心的活性至关重要16。所以无论是该区域的错义突变还是缺失突变,都严重影响酶活性,与基因型g1279CG(L427V)+1280-1291del12(L427LfsX20)相一致。4
17、号家系突变位点为c853CT(p.R285X),该突变为已报道突变,能导致终止密码子提前出现,产生截短蛋白。4例患儿母亲再次妊娠时羊水细胞的基因检测分别找到1个先证者携带的基因突变才是示胎儿为MSUD杂合子。培养后的羊水细胞排除了母源细胞污染的可能。目前尚未开展支链Om酸脱氢酶酶活性检测,故对MSUD患者母亲羊水细胞进行基因检测对产前诊断有重要意义。另外,羊水气相色谱-质谱检测支链酮酸均正常,进一步排除胎儿患病的可能性。已有研究证实,利用气相色谱-质谱技术检测羊水有机酸进行有机酸血症的产前诊断,方法可靠口刀。本研究通过家系BCKDHAxBDKDHA基因分析初步了解MSUD患儿的基因突变情况,并成功应用于产前诊断,如胎儿为纯合子,即为患儿,应综合考虑是否需要终止妊娠。
