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1、ICS 11.220CCS B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T56682023水禽圆环病毒感染检疫技术规范Technicalspecificationforcircovirusinfectioninwaterfowls2023-12-29发布2024-07-01实施中华人民共和国海关总署发布刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利o本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院畜牧兽医研究所
2、、厦门市翰均科检测科技有限公司、中华人民共和国石家庄海关本文件主要起草人:郑腾、傅光华、张体银、施少华、张志灯、黄瑜、王武军、程龙飞、王建昌、谢向机、陈翠腾、黄素文、万春和、傅秋玲、姜柒陈红梅、刘荣昌、辘、江南松。水禽圆环病毒感染检疫技术规范1范围本文件规定了水禽圆环病毒感染的临床诊断、聚合酶链式反应检测和实时荧光聚合酶链式反应检测要求。本文件适用于水禽圆环病毒感染(鸭圆环病毒感染和鹅圆环病毒感染)的监测、检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的
3、修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。U:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(CyCIethresh。Id)DNA:脱氧核糖核酸(DeoXyribOnUdeiCaCid)dNTP:三磷酸脱氧核昔酸(DeOXynUCIeoSidetriPhoSPhate)DuCV:鸭圆环病毒(DUCkCircovirus)EB:漠化乙锭(EthidiUmbromide)GoCV:鹅圆环病毒(GooseCircovirus)PCR:聚合酶链式
4、反应(Polymerasechainreaction)5疫病概述水禽圆环病毒感染是近年来倍受关注的新发现传染病之一,该病流行十分广泛,宿主谱广,不同品种、不同日龄的水禽均有报道,以生长迟缓、羽毛紊乱、体况消瘦为主要临床特征。水禽圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,基因组为单链环状DNA,主要包括鸭圆环病毒(DUCkCirCOVirus,DUCV)和鹅圆环病毒(GoosecircovirgGoCV)0该病毒主要侵害水禽的淋巴网状内皮组织,引起淋巴器官(特别是法氏囊)淋巴细胞减少,免疫力下降,导致宿主对其他病原(如大肠杆菌、巴氏杆菌或禽流感,鸭甲肝病毒及水禽细小病毒等)二次感染的易感性增加,影响其他
5、疫病病原疫苗的免疫效果。G。CV最早于1999年在发病鹅中被发现QUCV于2003年首次在患病鸭中被发现。我国自2005年和2008年首次分别报道了GoCV和DUCV在水禽中出现以后,各地饲养的水禽均陆续出现感染报道。G。CV核酸阳性率达35.4%,种鹅群GOCV血清阳性率在60.0%90.9%,鸭群DUCV阳性率则在10%81.6%。值得关注的是,目前已有在患病鹅中检测到DUCV的报道,说明两种水禽圆环病毒还存在交叉感染现象。6临床诊断6.1 临床症状感染圆环病毒的水禽可以出现以下症状:a)水禽群体内个体间生长参差不齐,感染水禽体况消瘦,体重与同日龄未感染健康水禽差异明显;b)羽毛杂乱,易脱
6、落,严重的出现背脊或翅尖羽毛完全脱落。6.2 病理变化6.2 .1剖检变化水禽感染圆环病毒一周以后主要免疫器官开始出现以下变化:a)胸腺出血或萎缩;b)法氏囊萎缩;c)脾脏萎缩。6.2.2组织学变化组织学变化如下:a)法氏囊淋巴滤泡结构消失,淋巴细胞显著减少;b)胸腺淋巴细胞显著减少,细胞核出现碎裂和空泡化;c)脾脏红髓和白髓边界消失,白髓淋巴细胞减少。6.3 初步诊断当水禽出现以上临床症状,结合病理变化,可初步诊断为疑似水禽圆环病毒感染,需要进一步进行实验室检测。7仪器和设备7.1 梯度PCR扩增仪。7.2 实时荧光PCR仪。7.3 台式冷冻离心机(转速不低于12000rmin)。7.4 微
7、量移液器(0.5L10L,2L20L,20L-200L,100L-1000L).7.5 组织匀浆器。7.6 电泳仪。7.7 电泳槽。7.8 紫外凝胶成像系统。7.9 冰箱(2。(:8。(:和-70。08试剂、引物和探针8.1水:符合GB/T6682中二级水的规格8.2 蛋白酶Ke8.3 10%十二烷基磺酸钠(SDS):配制方法按附录A中A.lo8.4 TriS饱和苯酚。8.5 酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24:1).8.6 3molL的醋酸钠溶液:配制方法按A.2。8.7 无水乙醇。8.8 75%乙醇:配制方法按A.3。8.9 漠化乙锭溶液:配制方法按A.4。8. 10IXTAE缓冲液:配制方
8、法按A.5。8.111.0%琼脂糖凝胶:配制方法按A.6。8. 12DNA分子量标准物:100bp2000bp38或无Ct值,二者均成立才可判定试验成立检验样本Ct值35,且在扩增产物DNA熔解温度(Tm)=(80.550.18)。C时出现单一的特异性峰,并且曲线有明显的对数增长期,报告DUCV核酸阳性;检验样本3538时,报告未检出DUCV核酸。扩增区序列见B.3o12鹅圆环病毒实时荧光PCR12.1 设立对照以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阳性样品作为阴性对照。以水作为空白对照。12.2 DNA提取同10.212.3 实时荧光PCR扩增12.3.1 反应体系在0.2mLPCR反应管中,按
9、表3配制反应体系,加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板,充分混匀。表3鹅圆环病毒实时荧光PCR反应体系(20L)组分加样量L终浓度ProbeqPCRMi(2)10IxGoCV-F(10molL)0.20.lmoLGoCV-R(10molL)0.20.lmoLGoCV-p(10moL)0.40.2moL水8.2一模板/对照1一12.3.2 反应程序将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪,扩增反应条件设定:95。C预变性2min;之后95。C变性15s,65。C退火20s,收集荧光,共45个循环。同时设阳性、阻性对照和空白对照。12.4 结果判断综合分析仪器给出的
10、各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阳性对照扩增曲线的最高点为准,具体根据仪器噪声情况进行调整,选择FAM通道进行分析o阳性对照样品有对数扩增曲线,而且Ct值30;阴性对照和空白对照无扩增曲线,而且Ct值40或无Ct值,二者均成立才可判定试验成立。检验样本Ct值35时,报告G。CV核酸阳性;检验样本35Ct值40时,重复一次,如果U值仍然40,并且曲线有明显的对数增长期,报告G。CV核酸阳性,否则报告GoCV核酸阴性;样本无Ct值或U值40时,报告未检出GoCV核酸。扩增区序列见B.4o13综合判定13.1 临床判定为疑似病例,经PCR扩增出现407bp左
11、右特异性条带,且经序列分析证明所获扩增产物与参考序歹IK见B.1)同源性达到90%以上的;或实时荧光PCR检测呈阳性的,可判定为GoCV感染。13.2 临床判定为疑似病例,经PCR扩增出现554bp左右特异性条带,且经序列分析证明所获扩增产物与参考序列(见B.2)同源性达到80%以上;或实时荧光PCR检测呈阳性的,可判定为DUCV感染。133临床判定为疑似病例,经PCR扩增出现407bp和554bp左右特异性条带,且经序列分析证明所获扩增产物分别与参考序列(见B.1)同源性达到90%以上的,或实时荧光PCR检测呈阳性的;以及与参考序歹IK见B.2)同源性达到80%以上,或实时荧光PCR检测呈阳
12、性的;可判定为DuCVGoCV共感染。13.4 被检水禽虽没有明显的临床症状和剖检变化,但病原检测符合13.1中病原检测判定标准,可判样品为GoCV感染;病原检测符合13.2中病原检测判定标准,可判样品为DUcV感染。附录A(规范性)试剂的配制1.1 110%十二烷基磺酸钠(SDS)称取SDS100g置于100OmL烧杯中,加入水80OmL,68加热溶解,温度降至室温后滴加浓盐酸调节PH至7.2,再加水定容至100OmL,室温保存备用。A.23molL的醋酸钠溶液(NaOAe)称取40.8gNaOAc3H2加入水40mL搅拌溶解,用冰醋酸调节PH至5.2,加水定容至100mL经L034IO5P
13、a高压灭菌30min后常温保存备用。A.375%乙醇取无水乙醵75OmL加入水25OmL,定容至100OmL20保存备用。A.4澳化乙锭(EB)溶液取漠化乙锭20mg加水至20mLA.5IXTAE电泳缓冲液A.5.1配制0.5molL乙二铁四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)称取二水乙二筱四乙酸二钠18.6Ig溶解于适量水中,混匀后用10%氢氧化钠溶液调PH至8.0,最后加水至100mLA.5.2配制50TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷(TriS)242g冰乙酸57.1mL0.5moL乙二铉四乙酸二钠溶液(pH8.0)100mL水至100OrnL用时用水稀释50倍后使用。A.5.3配制IX
14、TAE电泳缓冲液取50XTAE电泳缓冲液20mL加水至100OmLA.61.0%琼脂糖凝胶取琼脂糖LOg加入IXTAE电泳缓冲液至IoomL,加热至完全融化后冷却至5(C60。C时,再加演化乙锭(EB)溶液5L,摇匀后倒入制胶板中,待完全凝固后取下加样梳,备用0A.7IOX加样缓冲液聚蔗糖25g漠酚蓝0.Ig二甲苯青水0.1g至100mLA.80.01molL磷酸盐缓冲液(PBS)NaCIKCINa2HPO412H2OKH2PO48.0g0.2g2.9g0.2g将上述试剂溶于80OmL蒸耀水中,定容至100OmL,1.034Xi。Pa高压灭菌30min,4OC保存备用。附录B(资料性)参考序列
15、1.2 1PCR扩增的鹅圆环病毒基因序歹J(共407bp)AatctcgcgggaagtggtgggatggctataatgggcaggatgtggttgtgatggatgAtttttatgggtggctcccttacgatgaccttttaaggatctgtgatcgctatcctttacgGgttgagtataagggtggtatgacccagttcgtgtctaagacccttataattacttctaaTagggagcctcgcgattggtataaatgcgagtgtgatgtgtcggcattgtatcggagaatTaatcagtacctgatattaaccccggatggtta
16、tgcgcccgcccctgattttatgctgccgTtcccaataaactactagagacctggttaaggttagaataaggatcgtttattgtgtaaaAttacaataaagttatggtgcaagcccagtccattgtccgaatcttat1.3 PCR扩增的鸭圆环病毒基因序列(共554bp)AaccacgcgggaagtggtgggacggttactcgggaaatgacgtagtcgtcatggacgaCttttatggttggttgccttatgatgatttgctgagaattaccgaccgttaccctttacggGttgaatttaaaggcggt
17、atgactcagtttgtggctaagaccttgatcataacaagtaacCgcgagcctcgtgattggtacaagagcgagtttgacctttcagctctgtaccgcagaattaAcaagtatcttgtgtataacattgacaagtacgaacccgcccaggcatgtaccctcccgttCccaataaactactgagaccaatttgccgtgagtcgtttattaaggtaaacacttggcagGgtattacacttgggcagctcggttaaggttaggcacttggcagggattaaacacttgggCagctcggttaaggtt
18、aggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggtTaggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggttagaacaagatctcgTttatgcttagaa1.4 实时荧光PCR扩增的鸭圆环病毒基因序列(基于鸭圆环病毒CaP蛋白基因,共123bp)GgcgaagagcggcaactactcatacaagaggtgggtctttaccattaataaccctaccTttgaagattatgttcatgttctagagttttgcacgctcgacaattgcaagttcgctatcGTCGG1.5 实时荧光PCR扩增的鹅圆环病毒基因序歹J(基于鹅圆环病毒CaP蛋白基因,共82bp)AggtaatggttgcttctattgtcagaggtgctgcggtgtcctcggcttgtcttagtgaCatacccattccgtagaataccac附录C(资料性)PCR检测结果电泳图例PCR检测结果电泳图例见图C.IebpMl2345678bp标引序号说明:M-DNA分子质量标准物;1 一空白对照样品扩增结果;2 -G。CV阳性样品犷增结果;3 -DUCV阳性样品扩增结果;4 一阴性样品扩增结果;5,6鸭源待检样品扩增结果;5 ,8一鹅源待检样品扩增结果.图C.1PCR检测结果电泳图