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1、最新慢性HBV感染者血清HBVRNA检测及临床应用的专家共识要点一、背景慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染仍然严重威胁国人健康。现有的抗HBV药物核甘(酸)类似物nucIeos(t)ideanaIogues,NAs和聚乙二醇干扰素(pegyIated-interferon,PEG-1FN-a)尚不能在短期内治愈慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)o存在于肝组织内的共价闭合环状DNA(covaIentIycIosedcircuIarDNA,cccDNA)是HBV复制的源头，与慢性持续性感染和CHB难以治愈密切相关。但CCCDNA的检测需要有创的肝
2、穿活检，无法广泛开展。探索能够反映肝组织内CCCDNA存在及转录活性的血清替代指标，以客观评价抗病毒疗效及判定合适的停药时机乃当下之亟需。血清HBVRNA是近年发展起来的HBV病毒学指标，我国慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)和欧洲肝病学会(EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver,EASL)的乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南(2017年版)均指出，血清HBVRNA水平可反映肝组织cccDNA转录活性，与患者的病毒学应答及预后相关。2019年EASL和美国肝病学会(AmericanAssociationfortheStudyofLiverDisease
3、s,AASLD)联合发表的HBV治疗终点会议报告中，也提出将血清HBVRNA作为CCCDNA存在和转录活性的测定指标。近期，我国批准了第一款血清HBVRNA检测试剂，相信随着更多标准化HBVRNA检测试剂的诞生，将会极大地拓展其在临床中的应用。本共识将从血清HBVRNA的生物学特征、定量检测方法和临床应用3个方面进行阐述，并针对检测和临床应用作出推荐意见，以期更好地将该指标用于临床慢性HBV感染者的管理。二、血清HBVRNA的存在形式1. HBV前基因组RNA（pregenomicRNA,pgRNA）:1984年，MiIIer等首次在CHB患者血清中观察到以HBVDNA-RNA杂合分子形式存在
4、的HBVRNAo1996年，德国学者K6Ck等通过CDNA末端快速扩增的方法证实了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺昔酰（POlyA）化的HBVRNAo但直到20年后的2016年，才有学者证实血液中HBVRNA的主要来源为未经逆转录的HBVpgRNA,存在于有病毒外包膜包裹或裸的核衣壳内。考虑到可能的潜在感染性，国内学者将前者称为“HBVRNA病毒样颗粒”。此外，伴随着逆转录过程，P蛋白的RNaseH活性会将作为模板的pgRNA自逆转录起始点逐步降解，并由此产生3末端不同长度缺失的PgRNAoNAS在抑制负链DNA逆转录合成的同时，会显著增加3端缺失PgRNA的释放。2. HBVPgRNA剪接
5、变异体和3端截短型PgRNA：CHB患者血清中的HBVRNA主要来源于包裹在核衣壳内的pgRNA,且除了全长pgRNA及其逆转录残余外，还有不同形式的pgRNA剪接变异体和3,端截短体等。自1989年科学家首次在HBV感染者的肝脏中鉴定出pgRNA剪接变异体以来，已陆续报道20种可分泌至细胞外的pgRNA剪接变异体（SPl-SP20）。其中最主要的剪接变异体类型是剪接供体位点和受体位点分别位于2447nt和489nt的sp1,其含量可以达到pgRNA总量的30%oHBV基因组有位于1919nt的经典加尾信号(UAUAAA)和位于HBx编码区1787nt的非经典加尾信号(CAUAAA),分别产生
6、3.5kb全长PgRNA和缺失了两个加尾信号之间序列的截短型pgRNAo近期的研究结果表明，随着CHB患者治疗时间的延长和年龄的增长，截短型pgRNA占患者血清总HBVRNA的比例会有所升高。3. HBX转录本：近年来发现，HBX转录本也是血清HBVRNA组分之一，但含量较低。其存在形式主要有3种，分别为5,端始于HBx编码区第一个ATG上游的编码全长HBX蛋白的“典型”转录本、第一个ATG之后的编码截短HBx蛋白的转录本以及包含了P蛋白开放阅读框的超长HBx转录本。三、血清HBVRNA的定量检测1 .血清HBVRNA定量检测技术：目前用于定量检测血清HBVRNA的技术主要为基于TaqMan探
7、针法的逆转录-定量聚合酶链反应(quantitativereversetranscript!on-poIymerasechainreaction,RT-qPCR)o考虑到HBVRNA水平呈现出从PreC/C、S到X区的逐渐降低，建议将血清HBVRNA检测的靶区域设计在PgRNA5端，并尽量位于SPl剪接供体位点2447nt之前。此外，有研究在逆转录的引物上添加一段人工设计的随机“锚定序列”并作为定量引物，以排除HBVDNA的干扰。实时恒温扩增和检测技术（simultaneousampIificationandtesting,SAT）技术也已被成功用于血清HBVRNA的检测，该技术或有助于进一步
8、规避核酸提取产物中混杂的DNA对HBVRNA定量的干扰。推荐意见1:血清HBVRNA检测试剂的标靶区域应位于pgRNA的5端，并位于2447nt（sp1剪接供体位点）之前。2 .血清HBVRNA定量检测的溯源与标准化：中国食品药品检定研究院已经研制出“乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品”（批号340008-201901）,其来源于临床HBVRNA阳性患者的血浆冻干粉，单位为Uml,适用于HBVRNA定量检测试剂盒的质量评价。同时，也需使用不同试剂盒平行检测来源于不同临床场景（如不同自然分期、治疗史及病毒基因型等）患者的样本，比较HBVRNA定性结果（阴阳性结果）的一致性，比较定量结果的正确度
9、、精密度、抗干扰性、灵敏度、线性范围等关键性能指标，有助于商品化试剂性能的进一步完善。但目前仍缺乏国际公认的标准物质，HBVRNA定量检测的量值溯源和标准化也是目前迫切需要解决的问题之一。3 .血清HBVRNA定量结果的解读：表1总结了血清HBVRNA定量检测的不同结果形式，以及对应的解读。表1HBVRNA定量检测不同结果形式及其对应的解读HBVRNA（拷贝/ml或U/ml）解读未检出无扩增信号，未检出HBVRNA最低检测限WHBVRNA线性范围低限检出HBVRNA,阳性重现率295%,但定量值低于线性范围低限，定量值的CV20%线性范围低限WHBVRNAW线性范围高限检出HBVRNA,且位于
10、线性范围内，定量值的精密度可保证，CV20%线性范围高限HBVRNA浓度高于线性范围高限，如有必要，需稀释后复测和定量无效各种原因引起的结果无效，需重新检测注：CV:变异系数四、血清HBVRNA的临床意义1 .血清HBVRNA与肝组织内CeCDNA的相关性：血清HBVRNA主要由肝细胞核内的CCCDNA模板转录而来，故可用于反映CCCDNA的拷贝数量及其转录活性。研究发现，在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染患者中，其血清HBVRNA定量和肝内CCCDNA定量存在一定相关性(r=0.2500.781),不同研究之间相关系数的差异可能与队列患者临床特征以及血清HBVRNA和肝内CCCDNA检测方法的
11、不同有关。但对NAs经治的CHB患者，既往研究则显示血清HBVRNA定量和肝内cccDNA定量之间无明显相关性。然而，恩替卡韦(entecavir,ETV)治疗后患者血清HBVRNA水平与肝内cccDNA的转录活性(即肝内HBVRNA定量与cccDNA定量的比值)呈正相关(片0.584,0.001),提示NAs治疗后血清HBVRNA定量可能反映的是肝内CCCDNA的转录活性而非定量水平。此外，有研究巧妙地以拉米夫定耐药(IamiVUdineresistance,LAMR)突变位点(rtM204I/V)作为区分原有的和新合成cccDNA以及血清HBVRNA的特征性标志物，发现LAMR患者的血清H
12、BVRNA与肝内cccDNA的LAMr突变比例高度相关(FO.96,片0.0001),从“质”的角度阐明NAs治疗后血清HBVRNA水平与肝内cccDNA的相关性。对于PEG-1FN-治疗的患者，尽管近期一项小样本量研究报道，血清HBVRNA定量在治疗前后均与肝内CCCDNA定量呈中度相关(r=0.781、0.728,PQ.001)。但由于IFN对cccDNA和HBVRNA存在直接或间接的降解作用，PEG-1FN-a治疗下血清HBVRNA可否准确反映CCCDNA的水平及其转录活性仍需进一步明确。综上所述，对于未经抗病毒治疗或经NAs治疗的慢性HBV感染患者，血清HBVRNA有望作为反映肝内cc
13、cDNA定量或转录活性的标志物。推荐意见2:血清HBVRNA是反映肝内CCCDNA数量和遗传组成及其转录活性的无创性标志物，但应注意抗病毒治疗对血清HBVRNA与肝内cccDNA定量水平相关性的影响。2 .血清HBVRNA与其他病毒学指标的相关性：在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者中，血清HBVRNA水平与血清HBVDNA、HBSAg和HBV核心相关抗原(hepatitisBcore-reIatedantigen,HBcrAg)定量均呈正相关，且在HBeAg阳性CHB患者中更为明显；而在启用NAS抗病毒治疗后，患者血清HBVRNA与HBVDNA和HBSAg之间的相关性会逐渐下降甚至消失，但与H
14、BCrAg始终保持着较好的相关性；此外，对于接受PEG-1FN-治疗的患者，血清HBVRNA与HBVDNA和HBCrAg在治疗前后均具有良好相关性，但治疗后与HBsAg的相关性明显减弱，甚至失去相关性。推荐意见3:血清HBVRNA水平与其他血清病毒学定量检测指标的相关性应考虑抗病毒治疗状态的影响。经NAS抗病毒治疗后，血清HBVRNA与血清HBVDNA和HBsAg的相关性均下降甚至消失；但其与HBcrAg在治疗前后皆存在较好的相关性。3 .血清HBVRNA在区分HBV感染自然史中的价值：慢性HBV感染自然史可分为免疫耐受、免疫清除、免疫控制和再活动4期。但因缺少患者的肝脏组织学结果，临床上依据
15、无创性指标对患者的分期会有部分患者被归为“灰色阶段”，仍需无创性指标进行完善。早期曾有研究结果显示血清HBVRNA水平在自然病程分期中的分布规律与血清HBVDNA水平类似，且可用于预测CHB患者的自然史分期。近期中国香港和北美学者的横断面研究结果均显示，与以往传统的病毒标志物相比，血清HBVRNA在区分慢性HBV感染者的自然病程方面未凸显出应用优势。未来仍需在大样本量且有肝组织学结果的慢性HBV感染人群中进一步探究。4 .血清HBVRNA预测患者治疗应答的价值(1)血清HBVRNA预测NAs治疗应答：越来越多的证据表明，血清HBVRNA可用于预测CHB患者接受NAs治疗的应答情况，包括病毒学应
16、答和HBeAg血清学应答。最早来自德国的一项小样本临床研究结果显示，HBVRNA在治疗前以及治疗3个月或6个月后的下降水平，相较于血清HBVDNA或HBSAg,可以更好地预测HBeAg血清学转换。但考虑到绝大部分接受一线NAs治疗的CHB患者可实现病毒学应答，且患者发生HBeAg血清学应答与否并不改变治疗方案，因此，目前血清HBVRNA在预测NAs治疗应答方面的应用前景较为有限。(2)血清HBVRNA预测PEG-IFN-治疗应答：不同于NAS抑制PgRNA逆转录的抗病毒机制，PEG-IFN-抗病毒治疗机制包括调控宿主免疫、降解或沉默CCCDNA以及影响PgRNA的包装和稳定性等，治疗下血清HB
17、VRNA的下降也就更为明显。目前的研究结果显示，血清HBVRNA可有效预测PEGTFN-(I治疗应答，但与血清HBVDNA、HBSAg和HBeAg等传统病毒标志物相比，其预测效能并无显著优势。一项纳入了133例HBeAg阴性CHB患者的随机对照研究结果表明，PEG-IFN-a治疗12周与24周时的血清HBVRNA对于预测治疗应答(定义为72周HBVDNA2OOOIU/mL且ALT复常)的受试者操作特征曲线下面积(areaunderthereceiveroperatingcharacteristiccurves,AUROC)分别为0.630和0.668,进一步与传统的HBV标志物联合也未能有效提
18、高早期预测干扰素治疗应答的效能。在HBeAg阳性的患者中，PEG-1FN-治疗基线、治疗12周和24周时的血清HBVRNA水平虽也有预测HBeAg血清学转换的价值（12周预测效果最佳，AUROOO.75）,但与传统的HBV标志物相比，未见突出优势。在预测HBsAg清除方面，一项针对HBeAg阴性CHB患者的研究发现，PEG-IFN-a治疗12周时血清HBVRNA水平更低的患者更容易实现HBSAg转阴或HBSAg下降。类似地，另一项基于2个随机对照试验的研究（HBeAg阳性176例，HBeAg阴性103例）表明，在PEG-IFN-a治疗24周实现HBVRNA应答（定义为HBVRNA下降2Iog1
19、0Uml或下降1Iog10IUml且低于检测下限）的患者，其后期HBSAg转阴率显著高于未实现HBVRNA应答的患者（10.4%与0.8%）,且在伴有HBSAg下降1Iog10IUml的HBVRNA应答者中，HBSAg的阴转率更高（28.6%）。但一项纳入了727例HBeAg阳性患者的大样本研究显示，治疗12周HBVRNA和HBsAg水平在预测HBSAg转阴的AUROC分别为0.64和0.79,不如HBSAg预测其自身转阴的效能。Lim等也报道了类似的研究结果。推荐意见4:血清HBVRNA可用于预测CHB患者接受NAs和PEG-IFN-a治疗的应答情况。5 .血清HBVRNA指导患者NAS停药
20、的价值：尽管各大指南推荐对治疗前HBeAg阳性的患者在巩固治疗至少13年方可考虑停药，但按照该停药标准停用NAs1年内，患者的病毒学复发率和临床复发率仍分别高达30%100%和6%76%。因此，亟需新的无创性标志物用于指导CHB患者停药。作为反映肝内CCCDNA转录活性的无创替代指标，血清HBVRNA近年来受到广泛的关注。早在2013年，一项小样本（36例）研究通过回归分析发现，NAs治疗后3个月时的血清HBVRNA及HBVDNA载量与停药后病毒反弹显著相关（尸二0.043）o有学者观察到，HBeAg阴性感染者经NAs治疗后，即使HBVDNA被显著抑制，血清HBVRNA仍可持续被检测到。此后，
21、一项前瞻性停药研究（130例）的结果显示，血清HBVRNA可有效预测NAs停药后复发，停药时血清HBVRNA阴性的患者停药后4年累积病毒学复发率和临床复发率均显著低于HBVRNA阳性患者。与血清HBVRNA或HBVDNA单阳性的患者相比，HBVRNA/DNA双阴性的患者，其停药后4年的临床复发率更低（8.0%与31.4%）o此外，研究进一步发现，在停药时血清HBVRNA阴性且HBcrAg4Iog10U/ml的患者，其停药后4年期间临床复发率为0。另一项前瞻性研究（114例）也肯定了血清HBVRNA对预测NAS停药后病毒学复发的价值。该研究发现，停药时血清HBVRNA高于检测下限（44.6U/m
22、l）.低于检测下限和检测不到的患者，NAs停药后48周累积病毒学复发率分别为93.2%、52.1%和36.6%（P0.001）。需要注意的是，该研究也显示停药时HBVRNA检测不到且HBSAg10IU/ml的患者，在停药后48周累积病毒学复发率为9.1%o此外，血清HBVRNA也被认为可用于预测停药后HBSAg转阴情况。一项前瞻性队列研究发现，停药时血清HBVRNA阴性合并HBcrAg4Iog10U/ml的患者在停药I4年后的HBsAg清除率显著高于其他患者(16.1%与1.3%,P=O.002)o另一项随访时间更长的研究也展现出了类似的结果，停药时血清HBVRNA1OOO拷贝/ml的患者停药
23、后累计6年HBSAg清除率显著高于HBVRNA21OOo拷贝/ml者(30.9%与1.6%,后0.007)o综上所述，NAs停药时已实现血清HBVRNA转阴的患者停药后复发风险更低，但不能完全排除复发的可能性。目前比较明确的是，对于符合现行停药标准的接受巩固治疗的患者，若血清HBVRNA检测阳性，应持续进行抗病毒治疗以避免停药带来的疾病复发风险。推荐意见5:对于符合现行停药标准的接受巩固治疗的CHB患者，若血清HBVRNA检测阳性，应持续进行抗病毒治疗以避免停药带来的疾病复发风险。6 .血清HBVRNA预测肝细胞癌(hepatoceIIuIarcarcinoma,HCC)的价值：首个来自前瞻性
24、抗病毒治疗CHB队列(2974例)的研究发现，血清HBVRNA水平是NAs治疗过程中HCC发生的独立危险因素(校正HRHL”80.005),提示在NAS治疗过程中，血清HBVRNA转阴有利于CHB患者的长期预后。近期的一项病例对照研究结果也显示，NAs治疗过程中发生HCC患者的血清HBVRNA水平显著高于非HCC患者(P=0.004)o未来应进一步探索不同疾病分期和不同疗程下血清HBVRNA水平及其动态变化在HCC发生、发展中的作用。7 .血清HBVRNA与慢性HBV感染患者肝脏组织学的相关性：一项小样本（47例）研究发现，血清HBVRNA水平与CHB患者肝脏炎症活动度和纤维化分期均相关（尸0
25、.665、0.722,户/均0.001）,以2.45Iog10拷贝/ml作为截断值，血清HBVRNA均可以很好地区分炎症活动度和纤维化评分2和22的标本（AURoC=0.88、0.85）,且均优于血清HBSAg的诊断效能。研究进一步通过原位杂交技术观察到肝组织内HBVRNA阳性细胞多呈现“簇状”聚集分布且与HBsAg在空间位置上较一致，提示血清HBVRNA水平可反映肝内病毒的转录活性，且与肝组织活动度和其他病毒复制指标相关。综上所述，血清HBVRNA的定量检测及其临床应用近年来已成为本领域的热点，国际相关指南或共识也逐渐引用血清HBVRNA指标（表2）。表2血清HBVRNA检测指标写入国内外肝
26、病相关指南、共识或指导性文件情况汇总指南/共识相关描述发布学会/组织/作者欧洲肝病学会乙型肝炎血清HBVRNA在循环中的欧洲肝病学会病毒感染管理临床实践特征有待进一步研究；血指南（2017年版）清HBVRNA是研究CCCDNA转录活性很好的标志物；HBVRNA定量可能有助于预测NAS停药后病毒学反弹；血清HBVRNA在循环中的特征有待进一步研究中国慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）HBVRNA定量：与肝细胞内CCCDNA转录活性有关，在评估NAs停药后复发风险方面值得深入研究。目前存在的局限性在于不同研究团队采用的检测方法不完全相同中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会2021年亚太肝
27、病学会慢性乙型肝炎患者停用核苔（酸）类似物指导意见血清HBVRNA是反映HBV复制的另一种新型生物标志物，即使在NAS治疗后也可检测到Kao等慢性乙型肝炎病毒感染药物研发指导意见（草案）其中一些探索性终点可能包括：在治疗的各个时间点，定量HBSAg浓度的变化、HBeAg浓度、HBVRNA、HBcrAg.CeCDNA定量、HBSAg片段、HBsAg/抗-HBS免疫复合物美国食品药品监督管理局慢性乙型肝炎临床试验的设计和终点指南暨2019年EASL-AASLDHBV治疗终点专家会议报告停止NAS治疗后血清HBVRNA水平可预测治疗后的病毒反弹；必须对血清HBVRNA的测定进行标准化确证，以确保仅测
28、量HBVRNA（而不是HBVRNA、DNA的混合物）；需能够描述所测量的HBVRNA类型，并定义检测结果的临床用途Cornberg等治愈乙型肝炎的全球性科学战略研究消除HBV时应优先考虑到发展新的血清学指标（如HBcrAg和HBVRNA）,作为可靠的反映肝内cccDNA活性的生物标志物ReviII等专家共识：慢性乙型肝炎功能性治疗路线图血清HBVRNA可作为抗病毒治疗中HBeAg血清转换率的早期预测因子，也可作为停药后病毒学反弹和HBSAg逆转的潜在预测因子Ning等乙型肝炎的治疗：从发接受NAs治疗的患者血清Lok等现到监管批准HBVDNA未检测到的情况下，检测血清中的HBVRNA可以预测C
29、CCDNA转录活性，并已被证明是停止NAs治疗后病毒复发的预测因子；血清HBVRNA水平的检测，可成为监测CccDNA转录活性的一个有利替代指标HBV/HCV相关肝细胞癌近期有研究提出HBVRNA中华医学会肝病抗病毒治疗专家共识（2021年更新版）水平可以作为肝内炎症、纤维化程度的指标，其可能对HCC的发生、发展起作用，尚需要进一步研究学分会肝癌学组注：HBV:乙型肝炎病毒；HCV:丙型肝炎病毒；CCCDNA：共价闭合环状DNA；NAs:核甘（酸）类似物；EASL:欧洲肝病学会；AASLD：美国肝病学会；HBsAg:乙型肝炎病毒表面抗原；HBeAg:乙型肝炎病毒e抗原；HCC:肝细胞癌五、问题
30、与展望在检测方面，未来应在血清HBVRNA分子生物学表征的基础上开发更加准确可靠的血清HBVRNA检测方法。更重要的是，目前国际并无针对HBVRNA定量检测的标准品和标准化方法，血清HBVRNA量值溯源和标准化也是亟待解决的问题之一。在临床应用方面，由于依赖肝活检，肝内CCCDNA拷贝量和转录活性往往无法准确检测。前期相关研究结果表明血清HBVRNA在一定程度上能够反映CHB患者肝内CCCDNA转录活性，但区分慢性HBV感染自然病程的作用仍有待进一步在大样本、不同人群的队列中研究。在预测抗病毒应答方面，由于NAs治疗中HBeAg血清学转换的临床重要性受到挑战，因此，血清HBVRNA在预测NAs
31、治疗中HBeAg血清学应答的应用场景有限。尽管如此，血清HBVRNA在预测NAS停药后复发方面有着不错的表现，停药时实现血清HBVRNA转阴的患者停药后复发风险更低，可在临床上协助筛选真正可停药的患者，但该指标对停药后持续应答的预测价值仍有待研究。前期研究还提示血清HBVRNA可用于预测CHB患者的HCC发生风险，提示血清HBVRNA转阴有利于CHB患者的长期预后，未来也期待有大样本、长期随访的CHB抗病毒队列研究进一步阐明。随着抗HBV新药尤其是靶向衣壳组装兼具cccDNA合成抑制功能的核心蛋白变构调节剂类药物的研发和未来可能的成功上市,血清HBVRNA的临床意义将不断被挖掘和明确。最后，在卫生经济学方面，未来应明确应用该指标的临床场景，在充分发挥其诊断和疗效评估价值的同时，最大限度降低患者和社会的经济负担。
