《WST 478—2024血清25-羟基维生素D2和D3检测 同位素稀释液相.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《WST 478—2024血清25-羟基维生素D2和D3检测 同位素稀释液相.docx（6页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、KSI1.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T4782024代替WS/T4782015血清25-羟基维生素D2和D3的检测同位素稀释液相色谱串联质谱法Measurementofserum25-hydroxyvitaminD2andD3IsotopedilutionliquidchromatographytandemmassSpeciromctry2024-05-09发布2024-11-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布来源：WSZT4082012,定义2.3J3.6基质效应matrixeffect标本中除分析物之外的样M性质对分析物刈定结果的彬响.ab)c)d)c
2、)f)g)h)DDk)Dm)n)o)p)下列符号与缩略语适用于本标准.25(OH)VD2:25-羟法维生素D2(25-HyBSA:牛血清白蛋白(bovineSerUBalbumin)CV：变异系数(COeftkiemofvariation)1.OD:检出限(Iimitofdctoclion)1.I.MI:定JIt检测下限(ICWer1imitofmeasuringinterval)MRM:笠反应监测(*11tiplereactionmonitor)S/N:信噪比(Signaltonoiseratio)本标准建立的25(OH)VD2和25(0H)VD3依测方法以同位素稀郛液相色谐印联质谐法为检测
3、原理。方法是以稳定同位素标记的25SHNa和25(0H)小为内标添加至JlI1.滴中,内标与血清均匀混合后，通过加入碳酸盐缓冲溶液择放出与蛋白结合的25(0H)VDz和25(。HND.加入正己烷乙酸乙位混合溶液将其从血清当中萃取出来，将萃取液用低气吹干,用流动相初始比例溶液进行更溶.利用液相色诺中联而诺分离并检泅血清25SH)VDZ、25(0H)VD3和内标特异的离子对。通过建立的标准品工作曲戏以25(0H)YD?、25(OH)VD3与各自内标峰而枳比计算血清25(0H)VD?和25(0H)VD3浓度.6ttUH和E6.1试剂可选用的试剂如下：水：除非有特别说明，应使用GB/T6682定义的一
4、级水：甲醉：色谱纯;正己烷：色谐纯：甲酸:色谱纯：乙酸乙酯：色诣纯：残酸氯二的匕水合物盘a1HIQ7llj0):分析纯，CAS号：7782-JS磷酸二氮钠一水介物alP04-IW):分析纯.CAS号：10049-215：氯化钠：分析纯，CAS号：7&17-11-5：碳酸钠：分析纯.CAS号：497198;碳酸履钠：分析纯，CAS号:144-55-8;牛血清白蛋白(BSA):纯度9那，Mr=66kDu,CAS号：9048-16-8：初氧化钠：分析纯，CRS1310-73-2;25(0H)VDl标准品:纯度398%,CAS9：21343-40-8；25(0H)VD3标准品:纯度29SE.CAS:1
5、9356-17-3;25(Oil)VDi-Hj:同位素标记纯度Z97%,CAS号：1217467-39725(OH)VD-H:同位素标记纯度397%,CAS:140710-94-7可根据生产厂而说明iS行符合要求的相应调整，适用时，可采用下述方法进行样品前处理：a）移取血清样品或标准晶工作液OJm1.分别加入Ojm1.内标工作液、OJm1.碳酸盐媛冲溶液.充分混匀后舲置10min;b）加入正己烷乙酸乙油混合溶液0.8m1.在涡旋混合仪上混勾2min;c）3130g条件下黑心5min;d）充分吸取上消液转移至另一离心管中：e）将离心管沟I：赳吹仪中，适合的气流下氮气吹干；O加入流动机初始比例溶液
6、0.1ml.在涡旋混合仪上混匀1min;g）IlOOOg条件下禹心5min:h）取0.08m1.J1.清液至进样就中待测.9检NlJMt和分析分的港务9.1 液相色谱串联则M酸的准备9.1.1 液相系4分次备检测前应时液相系统进行准备,包括：a）流动相准备；按照本标准第6.2.5条，第6.2.6条准备流动相A,流动相B,超声除气IOmin15min;b）色诺柱的平衡：用合适的流动和比例（例如初始流动相比例）平衡色谙柱定时间，Il至色诺柱压力达到平衡.9.1.2 mm分的准备检测前应对侦谐系统迸行性健检件，包括：a）最近6个月内进行过旗吊校准；b）装配稳定的禹子源,如大气压化学电肉源（APCl）
7、、电喷雾电离源（ESD等.运行正常：O真空度达到正常工作要求的范围.所需辅助气体纯度和出力（波量）符合要求、供应充足、气路通畅。9.2 检测方法9.2.1 液相色谱Ik件9.21.1液相色谱仪IH昨使用者可以实现目标物与其他分析物有效分离并获得良好峥型为潦则进行条件优化，包括：a）色谱柱：见本标准第7.2条：b）流动相：见本标准第9.1.1条：c）流速：0.Smlmin;d）进样fit5UkO柱温：40-C;0进样涔温度：6TC.9.21.2液相色谱洗脱条件使用者可根据实验需要进行条件优化,见表1.1液相色谱洗联条件时间min流动和H%流动相B%03565120KO2.520802.51(1K
8、IO01004.0135655.535659.2.2Jt谱条件使用者可以彳效提高离子化效率为瞳则，优化离子源的类型、温度，以及芬化气、干煤气温度和流量等参数：以有效提高肉子传输效率为原则.优化推孔电压,碰推能盘等参数.进而实现提高检测灵敏度的目的，合理选择反应模式，使用者UJ根据实龄需要进行条件优化,包括：a)bc)e)nAJh).D国F源：APa：离子化电压，5500V；气南气：25psi;1:Medium;雾化电流：5UA:雾化渤度：350V;雾化气I60psi：驻留时间：0.1s;离子对(MRM模式):见表22Iti条件名称定Sb定性雄离子(nz)子廊子(flz去我电压(V)MtWlit
9、W(V)2S(XI)VI定量1113395.40Il定性413.3355.480M25(OH)VI-H1定量416.3398.37812定性416.358.478142S(Ni)VI定量401.4383.59013定性101.4365.5901625(OH)VV-H定量404.3：6.512015定性404.3368.41201792.3演相色谱率联按照以下步骤进行液相色谱串联质谱检测：a)按照本标准第8J条的方法对25(OH)VDz和25(0H)VD3标准品工作液和待测血清样品进行前处理.按照本标准第9.2.1条和第9.2.2条的条件进行液相色谱小联质谱参数设置和优ft;b)标准品工作液经前
10、处理后,按照浓改由低到高顺序进行液相色谱串联质谱分析：C)待测血清样品进行前处理后.进行液相色谱串联质谱分析.9.2.4结果计算9.2.41保留时间25(OH)VDl和25(0H)VD3在液相色谙中保留时间可依使用的色谱柱性能不同而有差异,建议分析物与标准品溶液保刷时间差值小于01min(6s).9.2.42工作曲戏的建立9242.1直线拟合m5(OIDXI)2和25(0H)Vl)J及f可位素标记的25SlDVDz和25(OIDY外按表2分别提取MRM离子色潜图，枳分得各自的峰面积。以标准品定量离子峥面枳与内标峰面枳的比值为纵坐标，以标准品浓度与内标勒浓度的比值为横坐标进行直觌拟合，按式(I)
11、得到工作曲莲参数a.bf,T-JX+b.H.M.H.W.e.Wl)HaCbW式中rA标准品工作液中25(OH)VDz或25(0H)VD3定址离子MRM枳分雎面枳：,s-标准品工作液中25SH)VDa或25(0VD,内标物MRM积分峰面积：Cx标准品工作液中25(0H)VD2或254OHNDS的浓度；Cs标准品工作液中25(0HND2或25(0HND3内标物的浓度,本方案中此浓度为50ng.m1.;R一拟合宜线的斜率：b拟合直线的截矩。直线拟合的相关系数r0.99,9.2.4.2.2建立工作曲线将本标准第9.2.4.2.1条中拟合得到的参数a.b带入式(2),得到工作曲线。常+(2)式中：Ag一
12、一血清样品中25(0H)VDJ或25SHN定量高广MRM积分帙面枳：Ar巾I清样品中2,OH)VD2或25(OH)VD3内标物MRM积分峰面积：Crct血清样品中25(0H)YD2或25SH)VD3的浓度：血清样品中25(0H)Vlh或25(0H)VDj内标物的浓度,本方案中此浓度为50ngl.;2按照本标准第9.2.1.2.1条中拟合得到的直找斜率；b一一按照本标准第9.2.4.2.1条拟合褥到的直线祓距.9.2.4.3血清样品中251八)2和25(011)浓度的计算对血清样品中25(0H)YD2和25(0H)VDs及同位素标记的25(刖VD2和25(0H)V按照去2分别提取MRM离子色谐图
13、，积分得各自的峰面积。根据本标准第9.2.4.2.2条得到的工作曲战，可计算得到式中C值,即血清样品中25(0HND2和25(OHND3的浓度.10方法验证10.1 说明实验条件优化后，需对方法进行多方面验证，例如粕密度、正确度、回收实验、雄性、1.1.MI和整质效应等.10.2 精密度依据己发布的行业标准等Mi莅性文件，对方法的格密度进行监证，定出检测卜,限浓度附近低值CY20%,其余浓度CV1S%,10.3 正ME适用时.可利用有证标准初版或若共他规数性文件方案进行验证,正ft度验证结果在肥tfl15%Ea内.10.4 StOII依据已发布的行业标准等规慈性文件进行回收实验,理论值为样本中
14、内源性分析物与所加入的标准品浓度之和，检测值应在靶值15%范附内。10.5 ttt依据已发布的行业标准等规范性文件,对方法的线性进行脸证I例如检测Ul清样品的战性筱用5nml.-200ng/n1.如收集到足量的更低浓度血清样品,经酸证后，可扩大战性范困的低限：如获得加入纯物质的更高值人也溃，经验证后，可扩大我性范第的高限,注I受标本本身浓度限制,高值Hl法为人血清加入纯物历兼得，低使血清为收集的人如金10.6 1.1.MI花S/N3条件卜按照已发布的行业标准规范文件计W1.OI).推荐使用35个接近1.Ol)浓度的样品.每个浓度至少探测1。次，1.1.MI和理论糠倜差应在15%以内,CV应20%。W.7am应依据行业内或1.；业领域认可的规范性文件，评价不同浓度时的基质效应，10.8住依据行业内或专业皱域认可的规范性文件，评价样品、坊控品及内标等槎定性，保证检测结果的在定可临
