入职培训之免疫学基础知识篇ppt课件.pptx

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1、入职培训之基础知识篇,免疫学基础,免疫学技术类型,免疫平台方法学,定义：研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应对抗原性异物排斥反应的一门科学。 现代免疫的概念已不再局限于抵抗微生物感染这个范围，它是指动物(人)机体对自身和非自身的识别，并清除非自身的大分子物质，从而保持机体内、外环境平衡的一种生理学反应。,免疫学 （immunology）,执行这种功能的是动物(人)机体的免疫系统，它是机体在长期进化过程中形成的与自身内(肿瘤)，外(微生物)敌人作斗争的防御系统，从而使机体获得特异性的免疫力，同时又能对内部的肿瘤产生免疫反应而加以清除，从而维持自身稳定。 免疫学是研究抗原性物质、机体的免疫系统和

2、免疫应答的规律和调节以及免疫应答的各种产物和各种免疫现象的一门生物科学，它是和医学与医学微生物学同时诞生的。随着生物化学、分子生物学等学科的发展，免疫学的研究亦已进入分子水平时代，而且向其它很多学科渗透，已成为生命学科研究所不可缺少的一门学科。,免疫系统（ immune system）： 是机体免疫功能的生理结构 ，它由免疫器官 、和免疫分子等组成.免疫器官:胸腺、淋巴结、脾免疫细胞：淋巴细胞、树突状细胞、单核/ 巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫分子：免疫球蛋白（B 淋巴细胞在 抗原刺激下变为浆细胞所产生的免疫分子抗体）、细胞因子、补体和HLA分子,免疫系统（ immune system）,

3、定义：是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以排除抗原为目的的生理过程。这个过程是免疫系统各部分生理功能的综合体现，包括了抗体递呈、淋巴细胞活化、免疫分子形成及免疫效应发生等一系列的生理反应。目的是通过有效的免疫应答，机体得以维护内环境的稳定。适应性免疫应答可分为三个阶段：1.识别阶段：T细胞和B细胞分别通过TCR和BCR精确识别抗原，其中T细胞识别的抗原必须由抗原提呈细胞来提呈；2.活化增殖阶段：识别抗原后的淋巴细胞在协同刺激分子的参与下，发生细胞的活化、增殖、分化，产生效应细胞（如杀伤性T细胞）、效应分子（如抗体、细胞因子）和记忆细胞；3.效应阶段：由效应细胞和效应分子清除抗原。,免疫应答,初次

4、及再次免疫应答抗体产生的一般规律,定义：能够刺激机体产生免疫应答，并且能够与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合的物质。 抗原的两种基本特性：1）免疫原性：指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答的性质。 2）免疫反应性：指抗原分子与免疫应答产物发生特异性结合的性质。,抗原 （Antigen),1）根据抗原性质分类：完全抗原具有免疫原性和免疫反应性的物质； 半抗原无免疫原性，只有免疫反应性。2）根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要Th细胞辅助分类：胸腺依赖性抗原 & 胸腺非依赖性抗原3）根据抗原的来源分类：天然抗原 & 人工抗原4）根据与免疫动物的亲缘关系分类： 异种抗原 & 同种异型抗原 &

5、 自身抗原,抗原的类型：,1） 异物性 2）分子量的大小 3）化学组成、分子结构与立体构象的复杂性 4）物理状态,决定抗原性的条件,一、 定义：抗原决定簇又称表位是指抗原性物质表面决定该抗原特异性的特殊化学基团，是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础。 由于抗原决定簇通常位于抗原分子表面，因而又称为表位。 二、大 小 ：抗原决定簇的大小是相当恒定的，如肌红蛋白的决定簇由67个氨基酸残基组成，伸长约为1.92.3nm，多糖抗原决定簇由6个单糖残基组成，大小为3.5nm;核酸的决定簇只有5个核苷酸组成，大小为2.0nm。 三、决定簇的数量： 抗原分子的抗原决定簇的数目称为抗原的抗原价。,抗原决定

6、簇,单价抗原只有一个决定簇的抗原 。如简单半抗原即为单价抗原。 多价抗原含有多个抗原决定簇的抗原称为多价抗原。 单特异性决定簇抗原分子只含有一种特异性决定簇称为单特异性决定簇。多特异性决定簇含有两种以上不同特异性的决定簇称为多特异性决定簇。 功能价位于抗原分子表面能与抗体反应的抗原决定簇称为功能价。 非功能价隐蔽于分子内部的抗原决定簇称为非功能价，经酶消化后才暴露出来。,一、不同物种间存在共同的抗原组成 二、不同抗原分子存在共同的抗原决定簇 三、不同决定簇之间有部分结构相同 蛋白质抗原的决定簇取决于多肽末端的氨基酸组成，尤其是末端氨基酸的羧基对特异性影响最大，如果末端氨基酸相似，即可出现交叉反

7、应，而且交叉反应的强度与相似性成正比,抗原的交叉性,异种抗原：与免疫机体不同种属的抗原，譬如各种疫苗，异种动物红细胞，异种蛋白等。同种抗原：与免疫机体同种属的抗原，能刺激同种而基因型不同的个体产生免疫应答。譬如血型抗原、同种移植物抗原等。 自身抗原：能引起自身免疫应答的自身组织成分。如在胚胎期从未与自身淋巴细胞接触过的隔绝成分（晶状体蛋白、脑组织等）或非隔绝成分，但在感染、药物、烧伤、电离辐射等因素影响下构象发生改变的自身成分。 异嗜性抗原：这类抗原与种族特异性无关，存在于人、动物、植物及微生物之间性质相同的抗原。该现象首先由瑞典病理学家Forssman 发现的，故又称为Forssman抗原。

8、,1、免疫球蛋白简称 Ig：指具有抗体活性的动物蛋白，存在于人和动物血液、组织液及其它外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于血液、组织液及外分泌液中。 2、抗体：动物机体受到抗原物质的刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体(简称Ab)。,抗体（Antibody),(一)重链(H链) :重链大约是由420-440个氨基酸组成，分子量大约为50000-77000，两条重链之间由1对或1对以上的二硫键(ss)互相连接。重链由可变区和恒定区组成；根据抗体恒定区抗原性差异，将免疫球蛋白的重链分为5种类型、，由此决定了

9、免疫球蛋白的类型，即 IgG、IgM、 IgA、IgE、IgD。 (二)轻链(L链) :轻链是由213-214个氨基酸组成，分子量约为22500。两条相同的轻链其羧基端(C端)靠二硫键分别与两条重链连接。 (三）免疫球蛋白的功能区 :免疫球蛋白的多肽链分子可折叠成几个由链内二流键连接成的环状球形结构，称为功能区。,免疫球蛋白的单体分子结构,根据抗体恒定区抗原性差异，将免疫球蛋白的重链分为5种类型、，由此决定了免疫球蛋白的类型，即 IgG、IgM、 IgA、IgE、IgD。,五类免疫球蛋白结构示意图,抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性

10、是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。,抗原抗体反应,抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。,特异性 即专性，是抗原抗体反应最主要的特性，是由抗原决定簇与抗体

11、分子高变区之间在空间结构上存在的互补性所决定的。这种结合的特异性，使得抗原抗体反应检测广泛用于对微生物感染的检测与鉴别诊断、分子鉴定等各个领域。,抗原抗体反应的主要特点,可逆性由于抗原抗体反应是非共价结合，因此其反应是可逆的，形成的抗原抗体复合物与游离的抗原及抗体之间处于一种动态的平衡状态；如改变溶液的理化条件(如盐离子浓度、酸碱度等)，可使抗原抗体复合物完全解离。抗原抗体反应的可逆性特点可用于对抗原或抗体的分离或纯化。当抗原抗体比例达到一个合适范围时，其反应可形成肉眼可见的沉淀或凝集现象：而当抗体或抗原过剩时，由于均不能形成大分子的免疫复合物，故沉淀物的形成相应较少，甚至无沉淀物形成。因此，

12、在进行抗原抗体反应检测时，须通过预实验确定二者合适的浓度比例。,抗原抗体反应的主要特点,抗原抗体反应的主要特点,免疫学基础,免疫学技术类型,免疫平台方法学,1. 双抗体夹心法2. 间接法3. 竞争法4. 捕获法,免疫检测的技术类型,原理： 用已知抗体检测双价或双价以上大分子抗原。以特异性抗体包被载体表面，然后加入可能含有相应抗原的待测样本，孵育后洗涤 ，再加酶标记的特异性抗体一起孵育。 包被抗体 、待测抗原和酶标抗体形成夹心式复合物。,双抗体夹心法,用已知抗原检测抗体用已知抗原包被固相载体， 加入待测样本，再与酶标记的二抗进行反应 ，加底物显色。是检测抗体最常用的方法。间接法的优点是只要变换包

13、被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,间接法原理,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点 ，因此不能用双抗体夹心法进行测定 ，可以采用竞争法模式 。其原理是标本中的抗原 （或抗体）和一定量的酶标抗原 （或抗体 ）竞争与固相抗体（ 或抗原 ）结合 。标本中抗原量含量愈多 ，最后的显色也愈浅。,竞争法原理,用抗人IgM 抗体包被固相， 以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM 抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。,捕获法原理-用已知抗体检测抗体，主要用于IgM检测,固相载体固相载体的要求理想的固相载体应与抗体（抗原）有较高的结合容量，

14、且结合稳定极少脱落；它可结合抗原或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；生物大分子固相化后仍应保持活性，而且为有利于与反映充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液；固相化方法应简便易行，快速经济。,免疫分析中常见术语,固相载体的种类和选择1.塑料制品 抗体或蛋白质抗原可通过非共价或物理吸附机制结合到固相载体表面。因材料经济、方法简便、操作及测定易于自动化，迄今用聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板仍是异相没免疫测定方法最常用的固相载体2.微颗粒 此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米（um），由于带有能与蛋白质结合功能团（如-NH2、-COOH、-OH、-

15、CHO或-NH-NH2等），易与抗体（抗原）形成化学偶联，且结合容量大。3.膜载体 包括硝酸纤维膜（nitrocellulose，NC）玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。,免疫分析中常见术语,免疫吸附剂免疫吸附剂是指与固相载体结合后的抗原或抗体，而将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。包被的方法依所用固相载体种类而有不同，可以是非共价健吸附，也可是共价键化学偶联。目前普遍使用的聚苯乙烯固相载体（如Elisa板）即多采用吸附方式包被抗原或抗体。除固相载体的理化性质外。用抗原或抗体包被后，固相载体表面常会余少量未吸附位点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本地偏高

16、。因此需用1%-5%的牛血清白蛋白（BSA）或5%-20%的小牛血清等包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭（blocking）。包被好的固相载体，加防腐缓冲液咋低温可放置一段时间而不丧失免疫活性。,免疫分析中常见术语,常见标记物 1. 常用酶 辣根过氧化物酶 （HRP） 碱性磷酸酶（AP）2. 金颗粒3. 其他标记物 荧光素 吖啶酯 放射性元素等,免疫分析中常见术语,碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP） 可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。不溶性底物： 硝基蓝四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）混合液，是AP最敏感的底物，呈紫

17、色； 坚牢红和萘酚ASMX混合液，呈红色AP可溶性底物 ： 一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。,免疫分析中常见术语,免疫分析中常见术语,底物液,1. 鲁米诺、异鲁米诺及其衍 生物类 （HRP底物）2. 金钢烷（1,2-二氧乙烷及其衍生物 ） AMPPD,目前市场常用底物液,免疫学基础,免疫学技术类型,体外诊断方法学及原理,体外诊断试剂在生物领域的分属（由医疗器械管理办法）,根据检测原理或者检测方法，体外诊断试剂可以分为：生化诊断试剂、免疫诊断试剂、分子诊断试剂、微生物诊断试剂、尿液诊断试剂、凝血类诊断试剂、血

18、液学和流式细胞诊断试剂等。生化、免疫和分子诊断试剂为我国诊断试剂主要的三大类品种。,体外诊断试剂按检测原理或者检测方法分类,体外诊断试剂三大主流领域对比,生物化学实验是把化学分析技术和生物化学实验反应原理的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。实验反应原理及分析方法理论依据目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现

19、了以酶为试剂测定各种代谢产物。,临床生化试剂,1. 比色法,生化项目常用的技术类型,2.免疫比浊法免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。基本原理：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。,生化项目常用的技术类型,具体见以下链接http:/,常见生化项目及所用技术类型,免疫分析方法学,酶联免疫,基于抗原抗体

20、反应的特异性和等比例性，以96孔聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算

21、出参与反应的抗原抗体的量，这就谁ELISA的原理。,酶免试剂盒常用原料,1.酶标板2.标准品(由抗原配置)3.包被抗体和酶标抗体4.底物液5.酶标仪6.说明书,酶免试剂盒常用原料,DH2+H2O2 D+2H2O 配方,显色反应原理,HRP,化学发光(ChemiLuminescence，简称为CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。（分为直接发光、间接发光和电化学发光）,二、化学发光,直接发光-吖啶酯标记间接发光-酶标记（HRP对应的

22、鲁米诺系统 ALP对应的MPPD系统）电化学发光,化学发光常用体系,吖啶酯发光,雅培（）,间接化学发光（化学发光酶联免疫技术）,辣根过氧化物酶-鲁米诺系统（HRP-Luminol）,碱性磷酸酶-AMPPD系统（ALP-AMPPD）,电化学发光,电化学发光,罗氏（roche）,板式发光 -包被抗体包被在包被板上磁微粒发光-包被抗体包被在磁珠上,根据包被固相载体可分为板式发光和磁微粒发光,板式发光,磁微粒发光,试剂盒常用在免疫层析的平台,三、免疫层析平台,标记物稳定性差，结果靠肉眼观测，检测灵敏度低，只能用于定性或半定量检测,胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通

23、常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。,胶体金,与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体

24、金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。,胶体金特点,胶体金原理,间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。,间接法,免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成

25、的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。,免疫荧光,荧光乳胶标记,荧光胶乳是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等方法吸附或包理到粒子内而形成的直径在纳米至微米级（0.0110m）范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。,上转磷光标记,时间分辨荧光,时间分辨荧光的特点,量子点标记,量子点,纳米磁珠标记,层析法常用标记物质,原理：利用碱基互补配对具有高度特异性而发展出的对核酸（DNA，RNA）进行检测的技术。即利用两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链的特性发展而来的检测技术。,分子诊断,一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术 1.原位杂交技术 2.生物芯片技术,常用的分子诊断技术平台,1.温度循环式核酸扩增技术2.恒温式核酸扩增技术3.多重PCR技术以及多重连接探针扩 增技术,二、基于扩增技术为基础的分子诊断技术（PCR）,主要是依靠基因测序仪 不同制造商提供的DNA测序平台及其测序方法,三、基于测序技术为基础的分子诊断技术,不同分子诊断技术的应用前景,