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1、聚合酶链式反应Polymerase chain reaction （PCR）,三峡大学医学院盛德乔,做什么?如何做?如何做好？,PCR目的,PCR体外（试管内）短时间内扩增获得大量的目的DNA拷贝能够扩增特异的基因短时间内能够扩增至百万倍必需知道部分序列！,Polymerase chain reaction (PCR) 是由 K. Mullis 于1983发明的, 这项技术通过模拟DNA的复制过程，在体外大量扩增目的DNA片段。PCR 技术使我们可以无限制地扩增我们研究的DNA 片段，特别是哪些不容易得到的目的DNA片段。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,简
2、 介,Kary B. Mullis,Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4,DNA复制的关键解链（模板）DNA聚合酶RNA引物,模拟DNA复制过程？,DNA复制解链（模板）多种酶和蛋白质RNA引物引物酶合成DNA链：DNA聚合酶,合成DNA模板解链： 变性热、酸、碱 引物： 退火合成！（RNA/DNA）新DNA链合
3、成：延伸DNA聚合酶 耐热 DNA聚合酶！,问题？聚合酶热稳定性？自动、程序化处理？,PCR基本原理,三步曲: 变性、退火、延伸类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,五要素:,PCR体系基本组成成分,模板DNA （Template） 特异性引物 （Primer） 耐热DNA聚合酶 （Taq） dNTP
4、s Mg2+,标准的PCR反应体系：,PCR仪,Bio-Rad 伯乐美国,Eppendorf德国,ABI公司ThermoFisher美国,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。实际上，有讲究！,引物（Primer）,设计引物应遵循以下原则,引物长度： 15-30bp，常用为20 bp左右。引物扩增跨度： 以200-500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，
5、G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。选择G/C为最佳。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。（常用！）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高
6、会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,如何设计引物？,手工设计PCR引物试剂软件专业软件：Oligo 6， Primer Premier半专业软件：DNAMAN, Dnasis ，Omiga，Dnastar在线引物设计Primer3: http:/frodo.wi.mit.edu/NCBI: http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,Primer3,Primer3 参数设置,Primer3 结果输出,Primer3 结果输出,BLAST-Basic Local Alignment Search Tool,选择物种,选择程序,Prime
7、r-BLAST,引物参数,设计引物引物的特异性,引物设计实践,请为扩增人IL-2全长cDNA设计引物！找人IL-2基因序列；NCBI/Nucleotide/interleukin-2分析序列; CDS设计引物 双链/互补链！,CDS 56-517 1 agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 61 caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 121 tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct ac
8、aactggag catttactgc tggatttaca 181 gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 241 taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 301 actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 361 cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat
9、ctgaaacaac 421 attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 481 taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 541 acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 601 gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 661 gattc
10、ttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 721 tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 781 taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa/如何设计引物？,Taq酶,酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应：一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶另一种为大肠菌合成的基因工程酶催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓
11、度过低则合成产物量减少。 TaKaRa TaqTM （5 U/l） Invitrogen AccuPrime Taq DNA Polymerase,一般Taq DNA 聚合酶活性半衰期为92.5 130min95 40min97 5minTaq DNA 聚合酶的出错率，一般PCR 中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环。（测序？）1.5-2 单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30 轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。,Taq酶特性,耐热性能保真性能是否为平末端如何选择？,Characteristics of T
12、aq Polymerase,dNTPs,dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。,在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,模 板,模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，
13、传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 蛋白质污染有机试剂污染,Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mmol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR条件优化,dNTPs浓度Mg2+浓度pH值Taq用量循环中每一步时间，循环数退火温度加入一些辅助物: PEG、BSA、甲酰胺引物设计,PCR循环参数,预变性 9495/5 min 循环（2535）变性 94/30 Sec
14、退火 5260 / 30 Sec 延伸 72/3060 Sec 延伸 72/10 Min 23小时完成！,PCR扩增产物分析,凝胶电泳分析 （大小？）琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 酶切分析 分子杂交 ：Southern印迹杂交 斑点杂交 核酸序列分析（突变？）,PCR常见问题,假阴性，扩增不出特异带假阳性出现非特异性扩增带 出现片状拖带或涂抹带,几种重要的PCR衍生技术,反转录PCR技术 (RT-PCR) 原位PCR技术 (in site PCR) 不对称PCR asymmetric PCR锚定PCR anchored PCR多重PCR Multiplex PCR实时定量PCR技术 Re
15、al time PCR,RT-PCR,定义：Reverse transcriptase-PCR （RT-PCR）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 优点：去除了内含子序列，包含所有的编码序列（表达？）；分子较小，易于操作；半定量。,RT-PCR,RT,PCR,步骤：提取样品中的总RNA总RNA 用oligo (dT) 作引物逆转录成产生 cDNA/RNA杂交链用一套特异的引物扩增靶基因。巢式PCR或常规,Re
16、al time PCR,实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。,扩增与检测分开进行使用荧光染料检测DNA对PCR终点的DNA量进行定性或定量使用凝胶区别不同片断大小的DNA,DNA Engine,常规PCR的检测
17、方法,实时定量PCR的原理,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图,起点定量,终点定量,终点处检测产物量不恒定,起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据。起点定量误差小，终点定量误差大。,实时定量PCR的原理,实时荧光 PCR的检测方法,Chromo4,在扩增仪上整合荧光检测元件使用荧光染料或荧光探针实时监测DNA产物的量通过扩增曲线分析初始模板中特定基因的量使用序列特异的探针区别不同的DNA通过双链DNA的熔解曲线鉴定不同大小和序列的DNA分子,实时定量PCR的原理,Threshold line,C(t) value,Ct值
18、的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。(Ct值可以通过标准曲线或经验来设定),实时定量PCR的原理,实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。,实时定量PCR的原理,确定初始模板的浓度初始模板的Log浓度与其Ct呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。浓度增加1倍，CT值减小1个单位浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位,Unknown contains 3108 copies,实时定量PCR的原理,荧光信号的
19、获取,光源,光学元件,反应管,光学元件,热循环仪,检测,实时定量PCR的原理,非特异性的荧光染料 SYBR Green I特异性的荧光探针 TaqMan 、 Molecular Beacon 等,DNA产物的荧光标记,Realtime PCR 常用的方法,SYBR green（荧光染料掺入法）在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后（与小沟结合），发射荧光信号。游离的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,Taqman probe （探针法）PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，
20、该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,实时PCR（Realtime PCR）技术原理,R荧光报告基团,Q荧光淬灭基团,Molecular Beacon （分子信标）一种特异的荧光实时PCR探针，这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸杂交事件，分子信标是一段双重标记的寡核苷酸(25-40nt)形
21、成具有一个环(探针) 和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在5端，淬灭剂3端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和淬灭剂分子通过探针自身互补形成的茎结构紧靠在一起，因此抑制了荧光信号。当PCR退火时，如果探针遇到靶DNA序列，信标将优先和靶DNA结合而不是形成发夹结构。由于茎结构被破坏，荧光报告物质与碎灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光。,实时定量PCR在生物学研究中的应用,DNA定量病原体检测转基因动植物研究和转基因食品检验基因整合拷贝数的研究 RNA定量基因表达量研究，mRNA基因型分析SNP分析法医学鉴定,实时荧光定量PCR 技术的主要应用,DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等,PCR反应的特点,特异性强灵敏度高简便、快速对样品要求低,临床医学领域病原体诊断遗传性疾病诊断肿瘤的诊断法医学,
