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1、二、病毒和细菌基因组的特点,1、共同点 基因组较小，只有一个环形或线性的DNA分子 多数序列用来编码蛋白质，基因间的间隔序列很短 功能相关的基因常串联在一起，由共同的调控元件调控，并转录成同一mRNA分子，指导蛋白质合成，称为操纵子。,2. 病毒基因组的特点,1）病毒基因组可以由DNA或RNA组成，但每种病毒只含一种核酸（单、双链，环形、线性）。,2）根据合成蛋白质的方式分类：,正链病毒：RNA进入宿主细胞后， 直接指导蛋白质的合成负链病毒：RNA进入宿主细胞后，先合成与其碱基序列互补的RNA, 再指导蛋白质合成双链病毒：RNA为双链，在宿主细胞中先以负链为模板合成正链RNA来指导蛋白质合成，
2、随后合成负链RNA, 构成双链RNA，并和蛋白质组装成新的病毒逆转录病毒：RNA进入宿主后，在逆转录酶作用下，合成与其互补的DNA（cDNA), cDNA转录生成mRNA指导蛋白质合成。,3）重叠基因 一段可以编码多个肽链的核酸序列 重叠基因普遍存在，超过基因总量的10%,3. 细菌基因组的特点,细菌染色体有一环形或线性DNA分子，只有一个复制起点 编码蛋白质的基因是单拷贝的，但rRNA基因是多拷贝的 基因组有多种调控区和少量重复序列 基因组中存在可移动的DNA序列（转座子）,三、真核生物基因组特点,基因组较大 核基因由多条线性染色体构成，每条染色体含有一线性DNA分子，DNA分子含有多个复制
3、起点。不存在操作子 功能相关的基因组成基因簇，基因是在多种调控因子的作用下协调表达。,3. 存在大量的重复序列,高度重复序列中度重复序列低度重复序列单一序列（非重复序列）,4. 有断裂基因,大多数为蛋白质编码的基因都含有不编码的内含子和编码的外显子。内含子将基因分割成断裂基因（不连续基因）真核生物的基因组含有大量重复序列和内含子，外显子所占比例较小。（人类：1.5%）,第六节 RNA的结构与功能,1. 碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解多为单链结构; 少数局部自身回折形成双螺旋（40%70%), 不能配对的碱基形成突环分子较小,组成特点,RNA通常是单链
4、线形分子(一级结构)2. 自身回折形成局部双螺旋(二级结构)3. 进而折叠（三级结构）4.多数形成核蛋白复合物（四级结构） 如：核糖体、拼接体、编辑体等。,结构特点,核糖核苷酸通过 3，5，-磷酸二酯键相连形成长链,RNA的种类、分布、功能,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,核糖体,RNA,核内不均一,RNA,核内小,RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,Sno
5、RNA,scRNA/7SL,-,RNA,核糖体组分,蛋白质合成模板,转运氨基酸,成熟,mRNA,的前体,参与,hnRNA,的剪接、转运,rRNA,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,RNA,信使RNA,转运RNA,RNA,核内小,胞浆小RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,蛋白质合成模板,转运氨基酸,的前体,的加工、修饰,蛋白质内质网定位合成,的信号识别体的组分,核仁小RNA,含量,80510-15,一、转运RNA的结构与功能,
6、tRNA占细胞RNA总量的15%，在细胞核内形成，分子量最小； tRNA在细胞质中将氨基酸转运到核糖体-mRNA中，指导蛋白质合成； 细胞内有50种以上的tRNA； tRNA分子较小，沉降系数平均为4S。,由7090个核苷酸组成含 1020% 稀有碱基 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G具有 TC,（一）tRNA的一级结构特点,稀有碱基,（二）tRNA的二级结构三叶草型模型,1,2,3,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,四环四臂,氨基酸臂：由7对bp组成，富含G， 末端为CCA，接受活化AA二氢尿嘧啶环（D环） 由814个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶核苷（D），与氨基酰tRNA合成酶的结合
7、有关反密码环：识别mRNA上的密码子可变环：大小是tRNA分类的重要指标假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷环（T C环）： 含有保守的T C顺序，可识别核蛋白体上的rRNA, 促使tRNA与核蛋白体结合,（三） tRNA的三级结构 倒L形,tRNA三级结构像倒写的字母“L” 氨基酸臂和T C臂同轴排列，形成12bp的连续双螺旋 反密码子臂和D臂同轴排列，跟氨基臂所在轴垂直 D环和T C环组成倒L的转角，两环间的氢键和碱基堆积力稳定了转角构象 D环， T C环和可变环中核苷酸残基形成了特定的碱基对，稳定了tRNA的三级结构,tRNA三级结构特点,tRNA的功能： 结合活化氨基酸（ 3-CCA-OH ），
8、搬运氨基酸到核糖体 识别mRNA密码子。 参与蛋白质的翻译。,rRNA的特点 rRNA占细胞RNA总量的80%，分子量最大 核糖体由40%的蛋白质和60%的rRNA组成 rRNA自身的构象决定了核糖体亚基的形态 催化肽键合成的是rRNA 蛋白质维持rRNA构象，起辅助作用,二、核蛋白体RNA的结构与功能,rRNA的功能 参与组成核蛋白体，催化肽键的形成。,rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,复杂的多环多臂结构,大肠杆菌16s rRNA,核蛋白体的组成,三、信使RNA的结
9、构与功能,结构特点：1. mRNA占细胞总RNA的3%-5%，含量最少2. mRNA编码区的核苷酸序列决定蛋白质的氨基酸序列3. mRNA分子中含有非编码区,4. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。 mRNA的帽子结构可保护mRNA免受核酸酶从5端的降解，并在翻译起始中起重要作用。,5. 大多数真核mRNA的3末端有200多个腺苷酸残基的结构，称为多聚A尾。其作用在于增加mRNA的稳定性和维持其翻译活动。,5末端帽子结构：m7GpppN3末端有多聚腺苷酸尾巴结构(polyA) 单顺反子（一条mRNA链上
10、有一个编码区）,真核生物、原核生物mRNA一级结构特点,（1）真核细胞mRNA,真核生物mRNA的共价结构,原核生物mRNA为多顺反子，无修饰碱基。（多顺反子mRNA：一条mRNA链上有多个编码区）,（2）原核细胞mRNA,原核生物mRNA的转录和翻译同时进行，不需剪接和加工，直接指导蛋白质合成真核生物先在核内合成包含内含子和外显子的mRNA前体，形成分子大小不均一的核内不均一RNA(hnRNA)。hnRNA通过剪接和加工，转化为成熟的mRNA, 进入细胞质，指导蛋白质合成。,真核生物、原核生物mRNA成熟过程的特点,内含子(intron),真核生物mRNA成熟过程,外显子(exon),真核生
11、物,原核生物,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,四、snRNA和snoRNA,核小RNA（ snRNA）含量及分布 主要存在于细胞核中，含量占总RNA量的0.1%1%。snRNA存在形式及作用snRNA均与蛋白质相连，以核糖核蛋白的形式存在。在hnRNA的剪接、细胞分裂和分化、细胞内物质运输及构成染色体等方面起作用。,核仁小RNA（snoRNA)： 位于核仁，几十几百个碱基。 snoRNA参与rRNA前体的加工以及部分核苷酸的甲基化修饰。,五、反义RNA和RNA干扰,反义RNA（asRNA)的特性 asRN
12、A在翻译水平上抑制基因表达，还可抑制DNA复制和转录。 asRNA稳定性较差。RNA干扰（RNAi) 利用双链RNA抑制特定基因表达的技术。（应用一段与asRNA序列互补的RNA，两者构成双链，稳定性增强，抑制率增加）,六、非编码RNA的多样性,高等生物的转录产物有97%以上是不编码蛋白质的。非编码RNA（ncRNA）：不编码蛋白质，以RNA形式发挥作用。,按ncRNA的功能分类催化RNA（cRNA)：核酶，有催化功能并参与RNA的加工 类似mRNA的RNA：指导RNA（gRNA): 指导mRNA编辑的小RNA分子tmRNA：既可以转运氨基酸，又可以作为模板端粒酶RNA: 作为染色体端粒复制的
13、模板 信号识别颗粒（SRP）：参与细胞内蛋白质的转运 微小RNA（miRNA): 参与基因表达和个体发育的调控 小干扰RNA（siRNA): 在RNA干扰中介导靶mRNA降解,ncRNA的分类,2. 按ncRNA的分布分类,核小RNA（snRNA） 剪接体snRNA U7-snRNA核仁小RNA（snoRNA) 最丰富的ncRNA, 参与rRNA及其他RNA的加工成熟胞质小RNA（scRNA） 位于细胞质，参与蛋白质的合成过程Cajal 小体小RNA（CBs） 参与核糖甲基化和假尿嘧啶形成,3. 按ncRNA的大小分类,2125nt的ncRNA 包括miRNA家族和小干扰RNA家族，参与基因表
14、达。100200nt的ncRNA 参与细菌细胞的翻译调节大于10000nt的ncRNA 参与高级真核生物的基因沉默,RNA既可以作为遗传物质，又可以实现蛋白质的使命,RNA可能是DNA和蛋白质的共同祖先；生物进化早期可能是一个由RNA主导的世界,核 酸 的 理 化 性 质,第 七 节,一、核酸一般理化性质,（一）核酸的水解,酸、碱、酶水解 水解位点在磷酸二酯键和糖苷键 DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别 碱性条件下，RNA可被稀碱水解；而DNA变性，但不被水解；可用此法测定RNA的碱基组成或去除RNA杂质 酸性条件下，糖苷键不稳定，嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键最易被水解；故对核酸部分水解时，很
15、少采用酸水解,（二）核酸的酸碱性质,1、碱基的解离,具有芳香环结构特点，能发生酮式/烯醇式互变碱基都具有弱碱性（主要是环内氨基的贡献）,2、核苷的解离 戊糖可增强碱基的解离 核糖中的羟基也可发生解离3、核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性,核酸为两性物质，通常具有较强的酸性（在中性溶液中带负电荷）； DNA等电点为44.5；RNA等电点为22.5,DNA是白色线性高分子，粘度极大；RNA为白色粉末，粘度较小 DNA和RNA均微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇从溶液中沉淀核酸 加热时，D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D-2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色,（三）核酸的其他理化性质,二、核酸的紫外吸收性质
16、,碱基含有共轭双键，可强烈吸收250290nm处的紫外光，最大吸收峰260nm左右核酸紫外吸收性质的应用 利用紫外光照相来定位测定核酸在细胞和组织中的分布 每摩尔碱基在一定PH下的紫外吸收值为定值，故利用此性质可定量碱基或碱基衍生物在纯溶液中的含量 利用碱基的紫外吸收性质可确定其在色谱和电泳谱上的位置 载体（浅蓝色荧光）， 核酸区（暗区）,增色效应 将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值会增加30%40%，这种现象称为增色效应,原因：双螺旋结构中，碱基有规律的紧密堆积降低了其对紫外光的吸收,DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或41.67g/
17、ml RNA） 20g/ml寡核苷酸 DNA浓度（g/ml)=OD260 50; RNA浓度(g/ml)= OD260 41.672.判断核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0含杂蛋白及苯酚，比值会降低,OD260的应用,三、核酸结构稳定性的因素, 碱基堆积力 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，碱基平面间的范德华力和疏水作用力共同组成碱基堆积力，是结构稳定的主要因素。 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 环境中的正离子 磷酸基上的负电荷与介质中的正离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于
18、DNA稳定。,四、DNA的变性(denaturation),（一）定义：在某些理化因素作用下，双螺旋区氢键断裂，DNA双链解开成两条单链无规则线团状态的过程。,变性时，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。 但不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变,核酸降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA变性,影响核酸变性的因素： 过量酸，碱，加热（一般75）， 变性试剂如尿素、酰胺， 某些有机溶剂（如乙醇、丙酮等）,变性后理化性质的改变：,OD260增高、粘度下降、比旋度下降、 浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、
19、 生物活性丧失,RNA变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显,核酸变性引起紫外吸收值的增加-增色效应,DNA的紫外吸收光谱,完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 约1.1%实质：碱基暴露,由于变性或降解引起核酸紫外吸收增加的现象称增色效应,OD260 : 单核苷酸单链DNA双链DNA,1. 解链曲线：如果在连续加热DNA稀盐溶液的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,（二）核酸的热变性及Tm,变性过程是“跃变式”的，而非渐变,2. Tm：变性在一个窄的温度
20、范围内完成，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。,双链RNA比双链DNA稳定，Tm高大约20 C 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间,3. 影响Tm的因素,G-C含量：G-C含量越高，Tm越高 经验公式:（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 溶液的离子浓度：浓度越低，Tm越低 离子溶液的PH PH大于11.3时，碱基不能形成氢键，DNA完全变性；PH小于5.0，DNA易脱嘌呤 变性剂：变性剂可破坏氢键，使Tm下降,五、DNA的复性,1. DNA复性(renatura
21、tion)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但生物活性一般只能得到部分恢复，具有减色效应。,减色效应DNA复性时，其紫外吸收降低,变性和复性是可逆的， 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。退火温度Tm25,2. 影响复性的因素,复性的温度：Tm25是合适的温度，不宜太低 单链片段的浓度：浓度越高，碰撞频率越高，复性越快单链片段的长度：片段越大，错配率越高，复性越慢单链片段的复杂度：重复序列越多，复杂度越小，越易形
22、成互补区，复性速度越快溶液的离子浓度：维持一定的正离子浓度，消除磷酸基负电荷引起的斥力，可加快复性,六、 核酸的分子杂交,热变性的DNA在复性过程中，具有碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化双链的现象。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,探针,探针技术：在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的新技术。探针(probe)：经同位素或荧光标记的具有特定碱基序列的单链核苷酸聚合体。探针可用于：基因诊断、致病基因的定位、Southern blotting、Northern blotting、原位杂交、DNA芯片技
23、术等临床实践和科研。,核酸分子杂交是根据两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法。 常用的核酸分子杂交方法： Southern 印迹杂交、Northern 印迹杂交 斑点杂交、狭缝杂交 原位杂交（菌落原位杂交、细胞原位杂交、 组织片原位杂交）,原位杂交法筛选DNA重组体图解,复印至硝酸纤维素膜上,用NaOH菌体裂解DNA变性,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cDNA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转
24、移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置测定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,基因芯片技术,将相关基因的探针排列在特定芯片上，样品DNA用荧光基团标记后与芯片进行杂交，通过检测杂交信号及其强度，进行基因诊断、并可对基因序列及其功能进行大规模、高通量的研究。,DNA芯片工作示意图,七、核酸酶,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依据底物不同分类DNA酶(DNa
25、se)：专一降解DNARNA酶 (RNase)：专一降解RNA非特异性核酸酶：既能水解DNA又能水解RNA依据切割部位不同核酸内切酶： 限制性核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,核酸酶的功能,本章小结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组）、二级结构（ 双螺旋模型、ZDNA等）、三级结构（超螺旋、核小体）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交,作业一1. 对双链DNA而言，若一条链中(A + G)/(T + C)= 0.7，则互补链中和整个DNA分子中(A+G)/(T+C)分别等于多少？维持核酸结构稳定性的因素有哪些？ 作业二1. 什么是Tm？影响Tm的因素有哪些？2. 简述RNA的种类及其主要功能。,
