第三章培养基ppt课件.ppt

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1、第三章 培养基,教学目标: 1.掌握培养基的种类及特点 2.掌握培养基的组成和适宜剂量 3.熟练掌握MS培养基配方 、配制及高压灭菌（重点） 4.了解生长调节物质的应用,培养基,种 类,成 分,生长调节物质的应用,配制与灭菌,教学内容,1.培养基的种类及特点,1.1 培养基的发展简史 培养基的产生最早是Sacks(1860)和knop(1861)对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，而设计出了由无机盐组成的Sacks和knop溶液，至今有的仍在利用作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基。,培养基,培养基(culture med

2、ium)：含有各种被培养生物材料所需要的营养成分的培养基质。培养基是组织培养中最重要的基质，选择合适的培养基对培养成功与否关系很大。培养基有各种种类，不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发表人的名字来命名，再加上年号，如White(1943)培养基，Murashing和Skoog(1962)培养基。,培 养 基 种 类,完全培养基,初代培养基,继代培养基,固体培养基,液体培养基,基本培养基,诱导培养基,增殖和生根培养基,基本培养基,根据培养基的无机盐成分和元素的浓度，可将培养基分为以下四类：1. 富盐平衡培养基： MS培养基；LS培养

3、基； BL培养基； BM培养基； ER培养基等。2. 高硝态氮培养基： B5培养基；N6培养基；SH培养基等。3. 中盐培养基： Miller培养基； H培养基； Nitsch培养基；Blaydes培养基。4. 低盐培养基： White培养基；WS培养基；HE培养基；改良Nitsch培养基及HB培养基。,几种基本培养基及特点:,MS培养基富盐平衡培养基： 无机盐浓度较高（钾盐、铁盐、硝酸盐含量均较高），元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力；微量元素种类齐全，浓度高；培养基营养丰富，在一般的培养中，无需额外加入复杂的有机成分。 能加速愈伤组织和培养物生长. 广泛用于植物器官、花药、细

4、胞及原生质体的培养。 Miller培养基中盐培养基 大量元素无机盐用量是MS的1/31/2 ；微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS 多，如增加了生物素、叶酸；无肌醇。 适合于大豆愈伤组织的培养和花药等培养。,几种基本培养基及特点,White培养基低盐培养基 无机盐量较低 ；有机成分含量相对也较低。 适合生根培养、胚胎培养等 B5培养基高硝态氮培养基 含有较高的硝酸钾，较低的铵态氮和较高VB1； 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。 SH培养基高硝态氮培养基 特点与B5相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。 无机盐浓度较高。,几种基本培养基及特点:,N6培养基：是我国学者创造（朱至清等

5、，1975）获国家发明二等奖。 主要特点： 成分简单； 硝酸钾和硫酸铵含量高 ； 适合花粉、花药培养 KM-8P培养基： 有机成分复杂，包括了所有单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸； 主要用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)。,通气性较好，便于操作,但营养分布不均，生长发育不一致。,营养分布均匀，生长发育整齐一致，但通气性差。,固体培养基与液体培养基,二、培养基的成分,植物激素,无机盐,有机物,培养体支持材料,辅助物质,水 分,2.1 水分,培养基大部分是水，配制培养基时一般用重蒸馏水，即蒸馏水再蒸馏一次，使水中不含或少含某些离子，保证培养基中成分完全人为控制。 水的作用: 1.水是细胞

6、原生质的主要组成成分； 2.水是重要代谢过程的反应物质和产物； 3.细胞分裂及伸长都需要水分； 4.水是植物物质吸收和运输及生化反应的良好溶剂； 5.水能使植物保持固有姿态，有利于光合作用和传粉； 6.调节植物体周围的温、湿度，维持植物体温稳定,2.2 无机盐(inorganic element),大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等元素。 以盐的形式加在培养基中，它们对植物细胞和组织的生长都是必不可少的，需要量大于0.5mmol/L。其中特别说明的是：培养基中无机氮的供应可以有两种形式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。微量元素：Fe，Mn，Zn，B，Cu，Co，Na，I等。 对于植物细胞和组织

7、的生长需要量小于0.5mmol/L，但必不可少，其中Fe较为关键，以螯合形式提供，可使用FeSO4.7H2O和Na2-EDTA进行制备。,2.3 有机物,维生素,肌 醇,氨基酸,天然复合物,椰 乳,香蕉泥,水解酪蛋白,碳水化合物,马铃薯,其 它,2.3.1 肌醇,主要生理作用: 参与碳水化合物代谢； 磷脂代谢及离子平衡作用； 促进组织快速生长； 对胚状体和芽的形成有良好影响常用浓度: 50-100mg/L。,2.3.2 天然复合物,天然复合物的成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显,椰乳是椰子的液体胚乳，主要含

8、有活性物质。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在1020%，它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。,椰乳(CM),香蕉泥1.对pH值缓冲大；2.用量150-200ml/L；3.应用在兰花组培。,香蕉泥,马铃薯：去皮和芽后使用，用量为150g/L-200g/L，煮30min，再经过滤，即可加入培养基。马铃薯汁也具有较大的pH缓冲作用，用添加马铃薯的培养基可得到健壮的植株。酵母提取液(YE)(0.010.05%)，主要成分氨基酸和维生素类。麦芽提取液(0.010.05%)；苹果汁、番茄汁、柑橘汁，黄瓜的果实，未熟玉米的胚乳等。以上这些天然复合物的特性是: 遇热较稳定，大多在培养困难

9、时使用，有时有效。,其它天然复合物,主要有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白(LH)等，是重要的有机氮源。 甘氨酸：能促进离体根的生长，对组织培养的生长也有良好的促进作用，通常用量为2-3mg/L； 丝氨酸、谷氨酰胺：有利于花药胚状体或不定芽的分化； 水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)：是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量是300-2000mg/L。,2.3.3 氨基酸(amino acid),2.3.4 碳水化合物,种类：蔗糖或葡萄糖、果糖等。蔗糖浓度：2-3%，胚培养为4-15%。作用：除提供碳骨架和能源，调节渗透压。 注

10、意： a.高压灭菌部分糖会分解。 b.大生产时可用白砂糖。,维生素以辅酶形式参与生物催化剂-酶系的活动，参与细胞的蛋白质、脂肪、糖代谢等重要生命活动。种类：VB1、VB6、Vc及生物素、叶酸、泛酸及泛酸钙等。 浓度：0.11.0mg/L 作用：VB1 促愈伤组织产生，提高活力 VB6 促根生长 Vc 防止组织褐变 烟酸 对植物的代谢过程和胚的发育都有一定作用。,2.3.5 维生素,2.4 植物激素,主要包括： 细胞分裂素(KT、ZT、6-BA、zip)； 生长素(2,4-D、IAA、IBA、NAA)； 赤霉素(GA3)等。,2.5 培养体支持材料,1.琼脂： 用量 610g/L；种类 琼脂粉、

11、琼脂条；琼脂糖。 作用 固化作用；无营养。 注意：琼脂使用有优缺点；新买应试凝固力。2. 其它： 玻璃纤维，滤纸桥，海绵等。,2.6 辅助性物质,抗生素,抗氧化物,活性炭,植物组织培养中材料的预先培养消毒只能进行表面灭菌，而对材料组织内部所带的细菌和霉菌的危害，则可在培养基中添加抗生物质。这对大量通气长期培养，也同样有效。常用的抗生素有：青霉素、链霉素、庆大霉素等；用量：520%；注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。,抗生素,链霉素,青霉素,庆大霉素,抗氧化物,1.常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC、PVP；2.用量：50200mg/L； 3.作用：防止氧化；抑制褐化，适用于热带木本及少数

12、草本植物。 4.注意：可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。,人参等中药,在组织培养中中药有其应用价值： 实验表明表现出明显的促进作用，尤其是和适量的激素配合时，效果更好。使用的多种中药中又以人参效果更好。,活性炭,1.作用：具吸附作用；防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1 0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）；有利于胚胎培养。2.常用浓度：0.510g/L 3.注意：活性炭具副作用。,3.培养基的配制,3.1 母液的配制和保存3.2 培养基的配制3.3 pH值的调整3.4 培养基的分装和灭菌,3.1 母液的配制和保存,经常需在配制培养

13、基时，为减少工作量，减少称量的误差，一般配成比所需浓度高10100倍的母液，用时可按比例稀释。 配好的母液需要贮存于2-4的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。,确定培养基,称量,计算,溶解,分装,定容,贴标签,保存,母液制备流程图,MS培养基配方,移母液,调pH值,培养基熬制,灭菌,称取蔗糖、琼脂,扎口,分装,定容,接 种,确定配方,3.2 培养基制备,当培养基配制好以后，应随即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存)，培养基pH值调整可用1mol/L HCl或1mol /LNaOH。经高压蒸汽灭菌后，由于某

14、些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度会增加，即pH值可降低0.2。因此在实际操作中，经常在灭菌前将培养基的pH调节至比所需pH高0.2个单位。,H值的调整,3.3 pH值的调整,培养基的pH值(培养基的酸碱度)，直接影响到培养物对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响，此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。 一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好的凝固。,3.4 培养基的分装和灭菌,配制好的培养基需趁热分装，琼脂约在40时凝固，所以有充足的时间来进行分装工作。分装后应立即灭菌，灭菌时压力表读数为0.81.1kg/cm2，121时保持一定

15、时间即可。培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间参考下表。,培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间表,4.生长调节物质的应用,生长调节物质(Plant growth regulator)是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着决定性的作用。生长调节物质除存在于植物体中，也可人工合成。 这方面的工作也是从20世纪30年代开始的，以后迅速发展，现在已可人工合成的种类相当多，可以说生长调节物质的研究、发展也是与植物组织培养的研究、发展相辅相成的。 生长调节物质主要包括生长素、细胞分裂素等。,生长素类,种类：IAA；NAA；IBA；2,4D 作用：诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。 浓度：0.055m

16、g/L,赤霉素（GA3）,种类：GA3 作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入 注意：不耐热。,细胞分裂素（CTK）,种类：6BA，KT，ZT 作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。 浓度：0.0510.0mg/L,生长调节物质的配制,生长调节物质一般在水中直接溶解比较困难，常用溶剂及热稳定性参考下表，溶解后，再加重蒸馏水定容。 为使操作方便，节省时间，生长调节物质也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。,植物激素的常用溶剂及热稳定性,在植物组织培养中生长调节物质的使用浓度因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素的使

17、用浓度范围为0.0510mg/L，细胞分裂素为0.0520mg/L。,生长调节物质的使用浓度,生长调节物质的应用方案,由于植物激素种类不同，诱导细胞增殖可分为四种类型：只需加一种生长素，如柑橘属组织、菊芋块茎；需同时加入一种细胞分裂素，如烟草茎叶、大豆子叶；只需加入一种细胞分裂素，如萝卜根木质部薄壁组织；不需加入生长调节物质，如某些植物的肿瘤组织和驯化组织。,1.生长素与细胞分裂素的比例也决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化是长根或是长芽。不同激素及其浓度会诱导产生不同的形态发生过程。这具体到每种植物也有不同变化。2.在组织培养中为了促进器官的分化和胚状体的形成，应注意：除去或降低所使用的生长素的浓度；调整培养基中生长素、细胞分裂素的比例；既要注意激素的比例，也要注意所添加的绝对量。,应用生长调节物质的注意事项,课后作业题,填空:1. 1962年，Murashige和Skoog为培养烟草花叶细胞设计了(MS)培养基， 其特点是(无机盐离子)浓度较高，且为较稳定的(平衡溶液)。2. White培养基(无机盐)浓度低，适合生根培养。3. 在组织培养中，不耐热的物质用(过滤)法灭菌，而培养基常用(高压蒸汽)法灭菌。4. 固体培养基熬制的主要目的是让（琼脂）溶解。,