第六章真核生物的遗传分析课件.ppt

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1、第六章 真核生物的遗传分析,第 一 节 真 核 生 物 基 因 组,一、C值悖理二、N值悖理三、真核生物基因组DNA序列的复杂度, 基因组(genome)：一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组。,一、C值悖理,6-1,25000, C值 (C Value) ：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。,最小的C值:支原体(106bp),最大的C值:显花植物、两栖动物(1011bp), C值是生物种的一个特征，不同生物之间差别很大。 生物结构和功能复杂程度增加,需要的基因数目和基 因产物的种类也越多,因而C值越大。,7-1,不同门类生

2、物的C值分布 (仿B. Lewin, 2000),哺乳类,硬骨鱼类,两栖类,显花植物,Go,支,软骨鱼类, C值悖理(C value paradox): C值的大小不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低，即物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖理，或C值佯谬。,高等生物的C值不一定高于比它低等的生物,C值悖理表现在两个方面, 结构与功能相似的同一类生物之间的C值差别很大，或低等生物的C值较高等生物的C值高很多 ;,真核生物的基因组比较庞大,人：基因组共有3.16109 bp 按1000个碱基编码一种蛋白质计算，理论上应有约300万个基因，实际大约只有2.5万个

3、。,对C值悖理的解释,Petroy: 各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果，即DNA丢失的速率愈慢，基因组DNA含量越高。,N值(N value): 一个物种基因组的基因数目称为N值。,二、N值悖理,N值悖理(N value paradox): 生物的基因数目与生物在进化树上的位置不存在正相关的事实称为N值悖理，或N值佯谬。,N值悖理现象说明： 生物体的复杂性不仅仅是基因数目的函数，随着生物复杂性的增加，基因的大小和基因结构的复杂性亦增加。 如：复杂的生物存在机制能使一个基因产生多个蛋白质分子，满足生理功能的需要。,生物的复杂性不能仅用基

4、因数目衡量，而应该 用整个基因组的理论上的转录物组衡量。,三、真核生物基因组DNA序列的复杂度,重复序列的检测方法： 通过复性动力学检测基因组DNA序列的复杂性。,即通过DNA的变性和复性反应的动力学过程分析 DNA序列的性质。,DNA复性的影响因素 DNA序列的复杂性 初始浓度 片段大小 温度 离子强度,真核生物DNA序列的类别,1. 单拷贝序列(unique sequence) ： 亦称非重复序列(nonrepetitive sequence), 在一个 基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝。,结构基因大多是单拷贝; 单拷贝基因具高度表达能力； 不是所有单拷贝序列都编码多肽链。,2. 中度重

5、复序列(moderately repetitive sequence) ： 中度重复序列中的重复单位平均长度约300bp,重 复次数为10102。,多为非编码序列，也有编码基因产物的，如人珠蛋白基因； 复性速度比单拷贝顺序快，比高度重复顺序慢。,3. 高度重复序列(highly repetitive sequence)： 在基因组中的拷贝数一般在106以上。通常这些序列的长度为6200bp，如卫星DNA。,大部分集中在异染色质区; 复性速度很快; 无转录能力；多数高等真核生物含20以上高度重复序列； 重复序列的确切生物学意义有待阐明。,高度重复顺序的功能, 维持染色体结构 许多反向重复序列是一

6、些蛋白质与DNA的结合位点。调节基因表达 参与基因表达调控的DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，使其免遭分解有重要作用。,参与转位作用 几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp，形成回文结构，在转位作用中既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。,与进化有关 不同种属的高度重复顺序，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。 如：人与非洲绿猴的卫星 DNA长度仅差1个碱基（前者为171 bp，后者为172bp），而且碱基序列有65是相同的，表明它们来自共同的祖先。,同一种属中不同个体的高度重复

7、顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹。卫星 DNA 成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序。,DNA在氯化铯中作密度梯度离心，此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。 DNA分子的浮力密度取决于GC含量, GC含量越高, 浮力密度越大。,卫星DNA (satellite DNA),卫星DNA定义 是一类高度重复序列，通常由2-10bp组成重复单位串联排列而成。由于其碱基组成（G-

8、C含量）不同于其它部分，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，常在主体DNA带的前面或后面形成次要小区带，就像卫星一样围绕着DNA主带，因而称为卫星DNA 。,CsCl 离心,卫星DNA分类, 人基因组中，卫星 DNA约占 5-6。 按其浮力密度不同 ： 1.687g/cm3 ： 1.693g/cm3 ： 1.697g/cm3 ： 1.700g/cm3,按其重复单元的核苷酸的多少 小卫星DNA(minisatellite DNA)：几百bp单元重复组成。 微卫星DNA(microsatellite DNA)：由2-20bp重复上千次。, 果蝇的卫星DNA分为三类，都是由7bp单元重复形成：

9、 ：5 ACAAACT 3 ：5 ATAAACT 3 ：5 ACAAATT 3 蟹的卫星DNA大部分为只有AT两个碱基的重复顺序组成。,卫星DNA位置,卫星DNA分布于着丝粒附近的异染色质区。卫星DNA在染色体上的位置可以用放射性探针作DNA分子的原位杂交来鉴定。,第二节 真菌类的四分子分析与作图,一、顺序四分子的遗传分析二、非顺序四分子的遗传分析,单倍体世代： 无性繁殖（为主）二倍体世代： 有性繁殖（短暂）,真菌的生活史,无性繁殖： 成熟子囊孢子(n,性孢子)萌发有丝分裂菌丝体,二倍体时期非常短暂，很快进行减数分裂四分子有丝分裂8个单倍体子囊孢子顺序地排列在一个子囊中：一个子囊中的8个孢子是

10、单一减数分裂的产物。,有性繁殖:两亲本必须是不同交配型A，B，各自的无性子囊孢子落在不同交配型子实体的受精丝上核融合2n核。,(一)四分子与8子囊孢子 1.四分子(tetrad)：脉孢菌减数分裂形成的4个单倍体子囊孢子在一起，称为四分子。,2. 八子囊孢子：四分子经一次有丝分裂，每一成熟子囊中含8个孢子。,一、顺序四分子的遗传分析,3. 顺序四分子(ordered tetrad) 由于脉孢霉子囊非常狭窄，以致纺锤体不能重叠，减数分裂所产生的四分子只能纵立于其长轴之中顺序直线排列，称为顺序四分子。,4. 脉孢霉8子囊孢子的特点： 8子囊孢子中邻接的每对孢子具有相同基因型(有丝分裂产生)。 即第1

11、、2对子囊孢子分别来自一条染色体的姊妹染色单体； 第3、4对子囊孢子分别来自其同源染色体的姊妹染色单体。,5. 顺序四分子的作用：子囊中子囊孢子的严格对称性质，证明减数分裂是一个交互过程(reciprocal process)。可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算某一基因与着丝粒的重组率。证明双交换不仅可以包括4线中的两线，还可以包括一个二价体的三或四线。可以检验染色单体的交换是否有干涉现象。,（二）着丝粒作图(centromere mapping),1. 概念:利用四分子分析法，以着丝粒作为一个座位，测定某一基因与着丝粒之间的距离，称为着丝粒作图。, 如果着丝粒与某一对杂合基因之间未

12、发生交换,则该基因与着丝粒不同步分离。此时，一对等位基因的分离为第一次分裂分离(first-division segregation) ，即M1，形成非交换型子囊。,第一次分裂分离（M1）及非交换型子囊的形成, 减时，同源染色体分离A和a分离(分别进入两个子细胞)。 减时，染色单体分离，A-A(a-a)分离，各自分别进入2个孢子。,有丝分裂8子囊孢子呈 (AAAA aaaa) 或 (aaaa AAAA)有序排列, 如果基因与着丝粒之间发生了交换,则该基因与着丝粒的分离同步。此时，一对等位基因的分离为第二次分裂分离(second-division segregation) ，即M2，形成交换型子

13、囊。, 若在减时，A-a之间发生了交换，使一条染色体的两条姐妹染色单体分别带有A和a，则尽管同源染色体分离，但两个子细胞仍同时具有A和a未分离。,第二次分裂分离（M2）及交换型子囊的形成, 直到减姐妹染色单体分离， A和a才随之各自进入一个子囊孢子中。, 如果一对等位基因的分离发生在第一次减数分裂，则基因与着丝粒之间未发生重组；如果两个基因的分离发生在第二次减数分裂，则说明基因与着丝粒之间发生了重组。, 鉴别第一次或第二次减数分裂的分离,可根据8个子囊孢子基因型的排列顺序。,3. 着丝粒距离的计算, 染色体上两个基因座的距离愈远，发生重组的频率愈高。 M子囊所占比例越多，说明该基因和着丝粒的距

14、离愈远。 由于每次单交换只涉及4条染色单体中两条，产生两个重组型和两个非重组型的染色单体，即一个子囊中只有半数孢子发生重组。因此在重组型子囊孢子中，只有两对孢子交换位置，其余两对维持原位。,每个交换型子囊中，基因位点与着丝粒间发生一次交换，其中半数孢子是重组型(重组型配子)。因此，交换值（重组率RF）的计算公式为：,4. 着丝粒作图实验： 链孢霉突变型与表型： 原养型：子囊孢子按时成熟，子囊黑色。 营养缺陷型：子囊孢子成熟慢，呈灰白色赖氨酸缺陷型(Lys-)与野生型(Lys+)杂交二倍体杂合子(Lys+ /Lys-)。杂合子减数分裂后，子囊的黑色孢子和灰色孢子有6种可能的排列方式。,表6-2

15、Lys+Lys-杂交子代子囊类型,7.3cM,（三）两个连锁基因的作图,粗糙链孢酶有两个突变型：烟酸依赖型(nic)-需在培养基中添加烟酸才能生长腺嘌呤依赖型(ade)-需在培养基中添加腺嘌呤才能生长,PD ：亲二型（parental ditype)，2种基因型，都为亲本型，包括和。 NPD：非亲二型（non-parental ditype)：2种基因型，都为重组型，包括和。 T：四型（tetratype) , 4种基因型，2亲本2重组，包括、和。,表 粗糙脉孢菌 n + + a 杂交结果,分析方法：, 两个基因是否连锁？ 若连锁，通过计算两基因之间图距以及每个基因与着丝粒之间图距确定它们在染

16、色体上的排序。,对于该实验结果的分析方法：,1. 连锁关系的判断,自由组合 连锁 本实验实际结果 PD/NPD1 PD/NPD1 898/2,结论：nic 与 ade 连锁,2. 重组值的计算（基因与着丝粒之间的图距）,= 5.05%,3. 判断着丝粒-nic -ade间的位置 目前已知nic和ade在同一条染色体上以及它们和着丝粒的距离，但还不知道具体的顺序排列。, nic、adc分别在着丝粒两侧异臂, nic、adc在着丝粒同侧同臂,两种方法确定：利用nic和ade都在M状态下时PD和NPD四分子类型出现的频率来判断这两个基因在同臂还是异臂上。分析nic、ade分别与着丝粒的重组率。,ni

17、c、adc在着丝粒同侧还是异侧 ？,实验数据显示： MM的PD子囊数为90， MM的NPD子囊数为1, PDNPD。故排除异臂，同臂成立。,若nic、ade在异臂，则PD与NPD都是由双交换形成，且机会应相等，因而PD与NPD的频率相等。,?,M的不一致率：若nic、ade分别位于着丝粒两侧，则nic、ade与着丝粒的重组互不干扰(独立)，这种机率只与它们分别与着丝粒的位置(重组率)有关。已知RF(0-nic)=5.05, RF(0-ade)=9.3，两者相差不到一倍。那么各自独立交换(M)的子囊数也应相差不到一倍。,分析nic、ade分别与着丝粒的重组率,但实际上，nic是M, ade是M(

18、仅着丝粒-ade间交换)的子囊有90个()；nic是M,ade是M(仅着丝粒-nic间交换)的子囊只有5个()。两者的比值远远超过重组值比值，故推翻两基因在着丝粒两侧的排列方式。,M的一致率：若两个座位在着丝粒同侧，一旦nic和着丝粒间发生交换，ade和着丝粒也应相应随着产生重组。实验结果：nic-着丝粒间重组(M)的子囊为101个(4、5、6、7型)，其中96个子囊(5、6、7型)同时发生ade和着丝粒重组，证明nic和ade位于着丝粒同侧。,已知 RF（0-nic)+ RF（nic-ade)= 5.05%+ 5.2%= 10.25% RF（0-ade)= 9.3% 即: RF（0-nic)

19、+ RF（nic-ade) RF（0-ade),原因：着丝粒和ade间发生过双交换，但在计算 RF (0-ade)时却没有计算在内，而在计算RF (0-nic)和 RF (nic-ade)时都各计算一次。,1. 酵母的生活史 酵母的生活史中，有单倍体世代和二倍体世代，两种世代均可通过出芽生殖方式进行无性繁殖。,二、非顺序四分子的遗传分析, 酵母的有性生殖： 两个不同交配型的单倍体细胞接合二倍体减数分裂4个单倍体孢子，包含在囊状的子囊中，子囊破裂形成单倍体细胞。 2. 非顺序四分子(unordered tetrad) 像酵母，减数分裂产生的四分子在子囊内无特定顺序，这种四分子称为非顺序四分子。,

20、3. 非顺序四分子分析 对酵母这类真菌的子囊孢子进行遗传分析称非顺序四分子分析。(1) 观察一对等位基因，尽管有两种分离的方式： 无交换发生,有交换发生。只能形成2种孢子，呈2：2的比值。,(2) 观察二对基因如Aa、Bb，连锁? 图距?ABab杂交，无论连锁与否，只能产生3种四分子。因为子囊孢子无序排列，所以仅考虑基因组合，不考虑分离类型(M或M)。, 确定连锁与非连锁根据重组率(RF) RF=0.5，A、B基因不连锁； RF0.5，则两基因座连锁。 在3种子囊类型中，T有1/2重组，NPD全部重组，则A-B间的重组率(RF)为：,例如： ABab结果：PD=0.56，NPD=0.03，T=

21、0.41,连锁基因作图通过计算重组率得AB间相对距离为23.5cM。不够准确。因可能存在双交换和多交换，导致RF值降低，图距减小。确切的基因间距离应是：实际测得的两基因重组值 + 2双交换值,？,准确否？,第 三 节 真核生物重组的分子机制,一、同源重组发生在减数分裂前期二、同源重组的分子模型Holliday模型,前言,意义：是变异的来源 保证了遗传多样性 为选择奠定了物质基础 使生物得以进化发展,遗传重组：造成基因型变化的基因交流过程称为遗传重组，是遗传的基本现象。,真核生物、原核生物；减数分裂性细胞内、体细胞内；核基因、叶绿体基因、线粒体基因间都可发生重组,前提条件：不同基因型的遗传物质彼

22、此能够转移,依据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求: 同源重组遗传重组 位点专一性重组 异常重组,其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同,同源重组（Homologous recombination） 又称普遍性重组(generalized recombination) ，依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子相互交换对等的部分。,一、同源重组发生在减数分裂前期,3. 特点 需要蛋白质参与（如：大肠杆菌需RecA蛋白、RecBCD蛋白）。 蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高，只要求两条DNA 序列相同或接近。 存在重组热点。 同源序列长度影响重组

23、。 真核生物染色质的状态影响重组的频率。,2. 发生条件 2个DNA分子序列同源，且同源区域越长越容易发生。,证据： 在细胞水平上，人们已经证明了在减数分裂前期，同源染色体配对，两条非姊妹染色单体之间发生断裂、重接和交叉，交叉就是断裂与重接发生的位置。,4.同源重组涉及到参与重组的双方DNA分子的断裂与重接,非姊妹染色体交换,在分子水平上，M. Meselson 和 J. J.Wergle用两个双标记噬菌体感染大肠杆菌的实验也证明了染色体断裂并发生再连接。,B,5. 几个概念 杂种DNA（异源双链DNA）：在重组处,每个双链都有一段区域是由亲本DNA分子的各一条链组成的，这个区域称为杂种DNA

24、（hybrid DNA）或异源双链DNA （heteroduplex DNA）。 分支迁移：重组接点沿双链移动。 交互重组：一条亲本双螺旋分子和另外一条亲本双螺旋分子共价连接，中间有一段异源双链区，这种重组称为交互重组。,分枝迁移双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散,细线期,合线期,粗线期,双线期,终变期,减数分裂时的染色单体之间的交换,Robin Holliday于1964年提出了重组的DNA模型（hybrid DNA model），又称Holliday model。既说明了同源重组的过程，又解释了基因转变现象。,二、同源重组的Holliday模型,b: 同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相

25、同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开,c: 切开的单链交换,d: 重接,e: 形成交联桥结构,a: 同源的非姐妹染色单体联会,Holliday模型对重组过程的解释,f: 交联桥沿配对DNA分子“移动”。 两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA (Holliday结构),g: 和f相同,h: 绕交联桥旋转1800,i: 形成Holliday异构体,J: 通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。,异源双链的形成,由图可知：无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，两DNA分子都含有一个异源双链DNA区。,“含异源双链的亲本

26、DNA分子”,“重组体 ”,Holliday结构的拆分,同源重组的Holliday模型,1,同源重组的Holliday模型,2,同源重组的Holliday模型,3,同源重组的Holliday模型,不管Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，两个DNA分子都含有一个异源双链DNA区,4,Holliday模型的意义:,解释了遗传学交换的相互性解释了环连分子产生的原因部分解释基因转变,第四节基因转变及其分子机制,一、异常分离与基因转变二、基因转变的类型三、基因转变的分子机制,在一个杂合体中，如果一染色体把基因A交给它的同源染色体，则它的同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌杂合体中，

27、一个座位上的两个等位基因分离形成子囊时，形成6种正常分离类型， A和a呈现2：2或1：1：1：1或1：2：1的分离，,异常分离（abnormal segregation）：,一、异常分离与基因转变,Mitchell 杂交试验：粗糙脉孢菌基因转变,好象是一个基因转变成为另一个基因，其邻近的基因仍然是2：2分离,Mitchell 杂交试验,+ pdxp x pdx +,发生原因： 基因突变？,因为频率远比基因正常突变率高得多。,由于重组，出现了完全野生型的孢子对(,)，但没有重组的对应产物双突变型的孢子(pdx, pdxp)，尽管pdxp出现异常的3:1分离，但紧密连锁的pdx基因却显示出正常2:

28、2分离。 这些反常的情况，好像是一个基因转变为它的等位基因，这种现象称为基因转变（gene conversion）。,基因转变与遗传重组有关,粪生粪壳菌子囊,粪生粪壳菌的基因转变,染色单体转变（chromatid conversion): 减数分裂的4个产物中只有一个发生转变，出现6：2分离； 2. 半染色单体转变（half-chromatid conversion)： 减数分裂的4个产物中有一个产物的一半或两个产物的各一半发生转变，出现5：3分离或3：1： 1 ： 3分离。,减数分裂后分离：等位基因的分离发生在减数分裂后的有丝分裂中,二、 基因转变的类型,1个产物转变,1个产物的一半转变,2

29、个产物的各一半转变,基因转变的实质： 重组过程中留下的局部异源双链区，在细胞内的修复系统识别下不同的酶切/不酶切产生的结果(一个基因转变为它的等位基因)。,两种校正方式： 不配对的碱基对由核酸外切酶切除，新合成的互补短链在连接酶的作用下连接上去。由于切除的不配对区段的不同，校正后或出现野生型或出现突变型。,三、基因转变的分子机制,或,图 不配对碱基对的两种修复校正方式,1. 两个杂种分子均未校正（图6-18a）, 复制后出现异常的44g（或3113）分离 半染色单体转变。,根据切除修复原理，基因转变的分子机制如下:,4两杂种分子都按原来两个亲本的遗传结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成G-

30、C、G-C、A-T、A-T的正常配对状态，子囊孢子分离呈现正常 44g的结果，如图6-18d所示。,3. 两杂种分子都被校正到+（或g）时（图6-18c）， 修复后出现62g（或26g）的异常分离 染色单体转变。,G,C,A,T,T,A,G/C: + A/T: g,共转变（coconversion）：几个基因发生同时转变的现象称为共转变。两个基因越近，共转变频率越大。,极化子 基因转变是有极性的：从单链断裂点开始，基因转变从高到低形成一个梯度。 极化子：在染色体上呈现基因转变极化现象的一个区域称为一个极化子。,第五节 体细胞交换与基因定位,一、单倍体化与体细胞交换二、有丝分裂交换与基因定位,例

31、:构巢曲霉 营养缺陷菌株1(n) 营养缺陷菌株2(n) 原养型菌落(2n) 异核体（heterocaryon）：两不同基因型的体细胞融合,形成同时含有两个细胞核的细胞、孢子或菌丝体等称为异核体。,一、单倍体化与体细胞交换,合核体（synkaryon）:大量异核体中的核保持单倍体状态,少数单倍体细胞核融合成为二倍体细胞核,即合核体.,如:构巢曲霉，绿色孢子 (w+y+) 黄色(w+y-) 白色(w-y+),分离子（segregant）：重组体、非整倍体或单倍体的总称。,单倍体化（haploidization）：体细胞在有丝分裂过程中,由于染色体不分离产生非整倍体或单倍体的过程。 三体：2n+1

32、单体：2n-1,有丝分裂染色体丢失（mitotic chromosome loss）：杂合体细胞中在有丝分裂后的子细胞重建时，发生一条染色体丢失的现象。,体细胞交换（somatic crossing over）：体细胞在有丝分裂过程中,同源染色体间发生的染色体交换。,aba: 对氨基苯甲硝酸y：黄色孢子ad16：嘌呤16ad8：嘌呤8bi：生物素,Stern在果蝇有丝分裂中发现了连锁基因交换。黄体（y），焦刚毛（sn）。,二、有丝分裂交换与基因定位,有丝分裂交换进行基因定位的原理：是依据体细胞同源染色体的交换使得染色体远端的杂合基因纯合化的规律，用来确定基因的排列位置和距离。 离着丝粒愈近的基

33、因纯合的机会愈小，愈远的愈大，而且，着丝粒一端的基因纯合不影响着着丝粒另一端基因的纯合。 如果两个染色体臂的基因同时出现纯合化，有可能是一条染色体丢失的结果。,有丝分裂基因定位原理,如：构巢曲霉,ad，pro，pab，y以及它们的显性等为基因的杂合体。y隐性纯合子中：pro，pab的纯合子：5.5%pab的纯合子：72%原养型：22.5 ad纯合子：0,y的相对纯合率为100%，说明y离着丝点最远,说明pro和pab中有一个离着丝点很近,说明pab离y很近，则pro离着丝点很近,说明pab与y之间发生交换的机率是22.5%,说明ad在着丝点的另一侧,准性生殖（parasexuality）：真菌

34、在二倍体的有丝分裂过程中，偶尔发生同源染色体交换，导致连锁基因的重组，这一遗传变异过程称为准性生殖。,第六节 体细胞融合与基因定位,一、细胞融合与基因定位,细胞融合（cell fusion）：两个或几个体细胞融合成为一个细胞的过程。是体细胞遗传学的核心内容，是应用体细胞遗传学技术进行基因定位的基础。,一、细胞融合与基因定位,1958年Okada第一次将两个不同的肿瘤细胞仙台病毒（日本血凝病hemagglutinating virus of Japan，HVJ）体细胞融。 融合后的细胞称为杂种细胞（hybrid cell），它含有两种细胞的染色体。 仙台病毒（sendai virus）在这里是促

35、融因子，UV灭活的仙台病毒介导细胞融合过程，该病毒可进入细胞膜内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥（cytoplasmic bridge）,仙台病毒，亦称HVJ，乙型副流感病毒。属副粘病毒属。曾主要应用于细胞工程中的细胞融合技术，基本原理在于HVJ含有细胞表面受体的结合位点，可以促使不同细胞凝聚，最终使细胞膜相互融合。直接产生这种作用的部位是HVJ病毒的外壳，而不是内部的RNA。但是应用HVJ技术有很多缺陷，如细胞感染率低，融合速度慢，反应条件高，融合体的去病毒困难。,聚二乙醇(polyethylene glycol, PEG)：也可显著地提高细胞融合频率，将一定浓度的PEG加入到培养液内，就可使

36、细胞发生凝集。由于PEG是非生物试剂，融合效率高，易于标准化，且价格便宜，因此PEG已成为广泛采用的融合剂，现已取代仙台病毒，它可使细胞膜部分降解，并在细胞间形成细胞质桥，可提高细胞融合的效率。,细胞融合过程可分为异核体（heterokaryon）和杂种（hybrid）细胞形成两个阶段。 在异核体阶段融合的细胞内含有来自两个亲本的细胞核。随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。,杂种细胞具有染色体消减（chromosome diminution）现象：随着分裂的不断进行，最初几代中包含了两种亲本细胞的全部染色体，在以后的增殖传代过

37、程中要失落一部分染色体。例： 小鼠大鼠杂种细胞丢失大鼠的染色体1020 人小鼠杂种细胞丢失人的染色体，最后可能只剩下少数的几条或1条人的染色体。,通过分析某一基因产物与某一人的染色体是否共同存在而进行基因定位。,例： 在杂种细胞中人的染色体是随机丢失的，在HAT培养基上只有携带有TK基因的人染色体的杂种细胞才能生长，丢失TK基因的不能生长。分析了许多杂种细胞克隆知道，凡是能在HAT培养基上生长的杂种细胞克隆都共同具有人的第17号染色体，这表明TK基因就在人染色体17上。,1、HAT选择系统,含Hypoxanthine aminopterin-thymidine 次黄嘌呤 氨基喋呤 胸腺 （胸腺

38、嘧啶脱氧核苷）,利用只有杂种细胞由于合成核苷酸的从头合成途径被氨基喋呤阻断后，可利用补救途径合成DNA，细胞能够分裂繁殖生存，而非杂种细胞因其补救途径被HGPRT、TK阻断，不能合成DNA，不进行生长而死亡，来选择杂种细胞。,（1）DNA的生化合成途径： 在细胞中核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成的主要途径，是由糖（核糖或脱氧核糖）加氨基酸进行合成。,如果代谢拮抗物氨基喋呤存在时，则这一途径受阻。在酶的作用下，启动补救途径（salvage pathway）。补救途径主要依赖于胸苷激酶TK ，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT，分别由基因TK和HGPRT编码。只有同时具有这两种酶的细

39、胞才能进行补救途径的合成。,（2）用小鼠的肿瘤细胞和人的成纤维细胞进行融合人的细胞：基因TK和HGPRT-小鼠细胞：基因TK和HGPRT 存在氨基喋呤时，小鼠细胞和人细胞单独都不能生长，融合了的杂种细胞能够在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基上生长，因为发生互补（complementation）。即小鼠的染色体贡献一个正常的HGPRT基因，人的染色体贡献一个正常的TK基因。,2、营养缺陷突变型标记系统 CHO 细胞已产生了许多营养缺陷突变型，已知在人-中国仓鼠细胞突变型杂种细胞中，人染色体也优先丢失。由于这种中国仓鼠细胞突变型属于营养缺陷突变型，因此只要将融合细胞群培养在不含有这一突变型所需

40、成分的培养基上，就可去除未被融合的突变型细胞。在这种条件下选出的杂种细胞不仅可保留能够与CHO 细胞营养缺陷突变型发生互补的人类特异性染色体，而且还能保留其他人体染色体。利用含多条人染色体的杂种细胞更便于快速、系统地进行基因定位。,二、同线分析,用体细胞杂种进行基因定位有两个步骤：第一，将某个基因定位于某一条染色体上，这称为染色体定（配）位（chromosomal assignment）；第二，将该基因定位于某一染色体的具体位置上，这称为区域定（配）位（regional assignment）。,连锁分析原理用于体细胞杂种染色体分析的方法称为同线分析（synteny analysis） 其基点

41、是：如果两个基因在一条染色体上，它们总是共同分离的；如果两个基因位于不同的染色体上，它们之间或多或少会发生自由组合。,如果是两种或两种以上的基因产物与某条染色体同时存在或同时丢失，就说明这两个基因在同一条染色体上，称同线（synteny），有的也把这种类型的测定方法称同线法。,例如有一个人鼠杂种细胞，是由一个具有两个突变基因（AB）的小鼠细胞系和一个具有两个相应的野生型基因（AB）的人体细胞系融合而成。（a）两个基因位于同一条染色体上,由于杂种细胞是无性生殖的，不会发生交换而产生AB或AB这两种重组类型,（b）如A或B位于人的不同染色体上,第七节 真核生物基因的删除与扩增及重排, 定义： 个体

42、发育过程中体细胞通过丢失染色体、丢失某些基因而去除这些基因的活性的现象称基因丢失。,一、基因删除(gene elimination),常发生于某些线虫（马蛔虫）、昆虫（小麦瘿蚊）和甲壳类。高等植物中未发现。,调控染色体丢失的主要物质是核酸,意义：,是基因调控的方式之一。被丢失的染色体上的遗传信息对体细胞来说可能没有什么意义，而对生殖细胞的发育也许是不可缺少的。, 定义： 基因组内某些基因的拷贝数专一地大量增加的现象。,二、基因扩增 (gene amplification),例如： 两栖类和昆虫的卵母细胞rRNA基因（rDNA）的扩增。 爪蟾rDNA的拷贝数 体细胞中为500个 卵母细胞为2 0

43、00 000个,外界环境条件改变引起基因扩增：,细胞培养液中添加氨甲蝶呤抑制二氢叶酸还原酶,抗性逐渐消失,基因扩增形成,同源染色区双小体, 双微体(double minute, DM)： 扩增的重复DNA片段从染色体断裂下来，因无着丝粒随机释放至胞浆，呈环状，经染色后成一对连在一起的双点状结构。, 定义： 指DNA分子核苷酸序列的重新排列，这些序列的重排不仅可形成新的基因，还可调节基因的表达。,三、基因重排(gene rearrangement), 生物学意义: 基因重排使细胞可能利用已有基因的片段，通过组合变化而产生更多的基因，提高对外界环境的适应性。,慢性髓细胞性白血病(CML)：chromosome 9 (C-ABL) chromosom22 (BCR)，形成融合基因BCR-ABL。,BCR,BCR,染色体重排,学 习 重 点,概念： 基因组、 C值(悖理)、N值(悖理)、单拷贝序列、中（高）度重复序列、顺序四分子、着丝粒作图、同源重组、异源双链DNA 、基因转变、基因删除、基因扩增、基因重排。掌握真核生物基因组DNA序列的类型、特点。掌握利用顺序四分子进行着丝粒作图的原理和方法。掌握真核生物同源重组的特点及Holliday模型。掌握基因转变的类型及其分子机制。了解基因删除、基因扩增、基因重排的意义。,