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1、过氧化物酶()活性的测定愈创木酚法,一、实验原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物。实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。在此酶存在下，H2O2 将愈创木酚氧化生成茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸收，故可通过470nm处的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。,二、材料和设备,、材料 ：马铃薯块茎 、仪器设备：751 型分光光度计、离心机、研钵、25ml 容量瓶、量筒、试管、吸量管。 、试剂：0.05ml/L愈创木酚溶液，0.05ml/L的磷酸缓冲液(pH5.5)， 2%H2O2，0.1mol/L儿茶酚溶液，20%三氯乙酸溶液,三、实验步骤,、酶液的制备取5.0g洗净去皮的
2、马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g水中离心10min，上清液转入25ml 容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。,、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml 2%H2O2、1.0ml 0.05mol/L 愈创木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加热5min的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，立即于37水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙酸终止反应。然后，过滤(或5000g
3、离心10min),滤液适当稀释，用751型分光光度计在470nm波长下测定反应体系的吸光度。,四、实验结果,以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位 酶活力=D 酶的比活力=D 式中， A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数,A,0.01t,A,0.01Wt,CAT过氧化氢酶活性测定方法,过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类，它专一性
4、地将细胞代谢产生的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体内积累，从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一.,过氧化氢酶的应用：,被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳）和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病
5、原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的重要指标。,过氧化氢酶的测定：,化学测定法：高锰酸钾滴定法，碘量法。光度法：紫外分光光度法，荧光分析法，化学发光法。电化学法：极谱氧电极法，电流测定法，电泳一染色法。放射化学测定法。简易气量测定法。,高锰酸钾滴定法：,过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标
6、准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 。即可求出消耗的H2O2的量。,酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示： 酶活(mgH2O2/gFWmin)= 式中 A对照KMnO4滴定毫升数； B酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT酶液总量（ml）； V1反应所用酶液量（ml）; W样品鲜重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。,紫外分光光度法:H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 以1min内A240减少0.
7、1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2样品管吸光值； Vt粗酶提取液总体积（ml）； V1测定用粗酶液体积（ml）； FW样品鲜重（g）； 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。,方法比较：研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器，适用性比较广泛。紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、快速、检测线相对较低得到优点。但是对于测定底物或产物改变量方面不太准确。,
8、总结：,综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时，影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定CAT活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择适合的测定的方法。,抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 在茶叶中,实验原理,APX（抗坏血酸过氧化物酶）催化AsA与H2O2反应而使H2O2:2AsA+ H2O22MD-AsA( 单脱氢抗坏血酸)+2H2O。抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为电子供体的
9、，APX首先与H2O2形成中间复合物，中间复合物接着氧化AsA形成产物，当AsA未被复合物利用时，APX失活。只要AsA能够再生，APX就能充分进行催化反应，从而保护叶绿体维持正常的光合能力。,APX酶液的制备,称取0.5g的茶树鲜叶剪碎，加入适量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴中充分研磨，离心（10000g、4、20min）取上层清夜1mL，分装于小离心管中置于4备用或-20保存。,APX活性的测定,提取液：50mmol/LPBS（磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液），pH7.8；2mmol/L AsA；5mmol/L EDTA。 反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5m
10、mol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。在三个比色皿中各加入20L鲜叶APX粗酶液，再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和H2O2启动反应；每10s连续记录室温下290nm吸光值的变化X。室温下每一分钟氧化1molAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）。,计算公式,每克鲜叶APX的酶活性U=（X7.51000601000）/（m2.82010）上式中，X：OD值的变化；7.5：每克材料提取7.5mL粗酶液；1000：将ml转化成L；60：将1min转化成60s；1000：将mmol转化成mol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8：吸光系数mmol/L cm；20：用20L酶液进行
11、活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。,测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件,PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍，提取液pH为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为0.5mmol/L。,注意事项：,（1）由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降低来计算APX活性，因此所加的酶量一般不宜过大，应使加液量控制在60s内，使产生的A290光值下降呈良好的线性关系。（2）由于此反应中AsA和H2O2量都很少，可以将30%的H2O2稀释500倍，在测定时直接吸取15L的H2O2与3mL反应液将加入到比色皿中，启动反应。（3）H2O2由于本身对AsA的氧化作用在测定时间内可以忽略不计。,超氧化物歧化
12、酶（SOD）的活性测定,黄嘌呤氧化酶法,原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2-），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。,实验试剂： 硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。,实验步骤：,计算方法：,每毫升反应液中SOD 抑止率达50时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算：SOD抑制率（）（A2-
13、A1）/A2100% SOD 活力（U/ml）（A2-A1）/A2100%50反应体系的稀释倍数样本测试前的稀释倍数 式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值。,邻苯三酚自氧化法,原理： 在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。 SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定 SOD 活性的理论依据。,1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2内含 2mmol/L EDTA)0.
14、2mol/L （Tris）三羟甲基氨基甲烷(内含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 与 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加双蒸水至 200ml调 pH8.20.01;邻苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰箱备用。 2.仪器: 紫外分光光度计，酸度计，恒温水浴锅,实验步骤：,（1）.邻苯三酚自氧化速率测定：在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris缓冲溶液，于25保温20min,加入1020ul 30mmol/L邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm下，每隔1min测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。,.SOD活性测定： 将样液加入到Tris缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。 活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u）。,
