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1、液体活检在胰腺癌中的应用,袁 周上海交通大学附属第六人民医院 普外科,1,胰腺癌流行病学,胰腺癌发病率和死亡率逐年升高,2008年世界癌症死亡统计,2012年世界癌症死亡统计,CA CANCER J CLIN 2011;61:6990CA CANCER J CLIN 2015;65:87108,2,2011年中国胰腺癌流行病学研究,近年来上海市胰腺癌流行学研究,11.13/10万,17.28/10万,9.91/10万,14.04/10万,中国肿瘤, 2015, 24(1): 1-10Cancer Letters 346 (2014) 273277,3,液体活检-胰腺癌诊疗新思路,1. Canc
2、er Discov; 6(5); 113 DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-14832. Oncol Rep 2016;35(3):1237-44,4,肿瘤筛查和早期诊断,实时监控治疗反应,评估转移复发及预后,指导靶向治疗,指导治疗干预措施,CTC 和ctDNA,Exosomes,胰腺癌CTC研究,5,预后判断,治疗监测,胰腺癌诊断,CTC cluster,转移机制,耐药性,Int J Cancer 2014; 1;134(1):1-8,CTC：胰腺癌诊断,6,1. Nature. 2010 Oct 28;467(7319):1114-7 2. Cell 2012;14
3、8(1-2):349-613. Gastroenterology 2014;146:647-51 4. PLoS One. 2014 Oct 31;9(10):e111597,CTC：胰腺癌治疗监测,7,动物实验表明：药物有效治疗后CTC数量显著降低,胰腺癌患者术后CTC先下降后上升，可能是因为潜伏的disseminated tumor cells 再次被激活,PLoS One. 2014 Feb 19;9(2):e89474Int J Cancer. 2015 Mar 1;136(5):1228-33,CTC：胰腺癌预后,8,CTC阳性患者：总生存时间较差，HR=1.23；无进展生存期更短，
4、HR=1.89,Tumor Biol. (2014) 35:24732480,CellSearch检测CTC判断预后,9,16名b期PC患者，8名检出CTCCTC阳性MST：52.5天CTC阴性MST: 308.3天,J Hepatobiliary Pancreat Surg (2008) 15:189195Annals of oncology, 2013, 24(8): 2057-2061,79名局部晚期PC，9名患者在基线或治疗后2月检测出CTC，检出率11%CTC阳性OS较差,P=0.01,CellSearch联合表面分子标记物更准确判断预后,10,经典的CellSearch检测CTC对
5、转移性PC的预后价值判断有限结合MUC-1更好的对患者进行危险分层,Pancreas. 2016 Mar 10 DOI: 10.1097/MPA.0000000000000619,CellSearch检测CTC评估肿瘤转移,在PC患者术后2-3年，术中门静脉CTC阳性提示较高的较高肝转移发生率（ 53 vs. 8 %, p=0.038 ）CTC的数量变化辅助判断不同手术方式效果，术前两组门静脉CTC无差异，术后标准手术组CTC升高而非接触术式组CTC不变,11,(Medicine 95(16):e3407),Tumor Biol. (2015) 36:991996Medicine (Balti
6、more). 2016 Apr;95(16):e3407. doi: 10.1097/MD.0000000000003407JAMA Surg. 2014 May;149(5):482-5,胰腺癌CTC检测-CellSearch,12,CTC检出率较低 晚期PC检出率 5%-42% 检出数量较少 1-10个/7.5ml无法进行后续培养,在EMT过程中CK、EpCAM等上皮标记物表达减少或消失，上皮表型细胞减少，间质表型细胞增多,胰腺癌为乏血供组织，血流量较正常胰腺组织减少约60%,CTC通过门静脉系统在肝脏内被清除,基于大小的胰腺癌CTC检测,13,优势：检出率高，检出数量多；细胞完整性好；不
7、受细胞表面标记物影响；可检出CTM；可进行后续分析不足：不易检出小于8m的肿瘤细胞胰腺癌：ISET、ScreenCell等,ISET-结合多种表面标记物确定CTC,根据肿瘤细胞形态学确定的CTC对PFS (P=0.85)和OS(P=0.36) 无判断作用利用表面标记物研究CTC Epithelial CTC： CK+/CD45-/15m（78%），提示预后不良 Mesenchymal CTC：CK+/Vim+/ CD45-/15m（52%），提示术后复发更多标记物值得去探究，如EMT过程中表达不下调的Plastin3,14,British Journal of Cancer (2012) 10
8、6, 508 516 Ann Surg. 2016 Jan 7, DOI: 10.1097/SLA.0000000000001600Cancer Res. 2013 Apr 1;73(7):2059-69,ScreenCell-结合KRAS突变鉴别CTC,15,联合细胞形态和KRAS突变检测胰腺癌CTC，KRAS突变可以作为判定CTC分子学特征可在不同分期PC患者检测到，检出率较高，分别为73%-86%67%-73%的CTC检出KRAS突变KRAS突变CTC与预后有关,Pancreas 2015;44: 547550Tumour Biol 2016; 37(6):7547-54,SE-iFIS
9、H方法检测CTC,16,SE-iFISH：差相富集技术联合免疫荧光染色及染色体荧光原位杂交技术,CTC鉴定方法,CK是上皮细胞来源标记物，免疫染色为绿色CD45白细胞表面的共同抗原，免疫染色为红色DAPI用于标记细胞核，染色呈现蓝色8号染色体多倍性是胰腺癌一个重要特征，FISH染色为橙色CTC 的表型： CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2， CK+/CD45-/DAPI+/CEP82，CK-/CD45-/DAPI+/CEP82白细胞的表型为CK-/CD45+/DAPI+/CEP8=2；未定性细胞表型为CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=2,17,典型细胞图像,白色箭头所示为CT
10、C，红色箭头所示为白细胞，绿色箭头所示为未定性细胞,18,CTC计数诊断胰腺癌ROC曲线,ROC曲线下面积0.954当CTC计数临界值为2个/7.5ml，约登指数最大，为1.78CTC2个/7.5ml 定义为CTC阴性，CTC2个/7.5ml 定义为CTC阳性,19,CTC阳性率与临床病理学参数关系,20,联合CTC计数与CA19-9诊断胰腺癌,21,CTC计数与胰腺癌生存时间关系,本组患者中位时间生存时间为10.2月（3.9-21.6月）CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间15.2月（8.4-21.2月）CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间10.2月（3.9-16.4月）,22,Co
11、x比例风险回归模型,CTC3个/7.5ml（HR=4.547；P=0.016）和-期肿瘤（HR=2.742；P=0.012）是胰腺癌不良预后的独立判断因素,J Exp Clin Cancer Res. 2016 Apr 12;35(1):66,23,CTC：肿瘤耐药性,在NSCLC中，CDX小鼠模型 (CTC derived xenograft)对化疗药物反应类似提供CTC的患者，便于检测化疗耐药性在乳腺癌中，培养CTC细胞系，进行药敏试验，难治性肿瘤的提供新治疗药物，进行个性化治疗方案通过对接受和未接受AR (androgen receptor)抑制剂治疗的前列腺癌患者CTC，发现非经典Wn
12、t信号通路激活，Wnt5a异常表达抑制药物疗效,24,1.Nat Med. 2014 Aug;20(8):897-9032. Science. 2014 Jul 11;345(6193):216-203. Science. 2015 Sep 18;349(6254):1351-6,CTC在肿瘤转移发中的作用,25,Nature. 2016 Jan 21;529(7586):298-306,CTC：肿瘤转移机制,在前列腺癌中，CTC全外显子组测序揭示70%的CTC突变与肿瘤组织一致在乳腺癌CTC中分离出MIC（ metastasis-initiating cells ），证实EPCAM+/CD4
13、4+/CD47+/MET+类型细胞具有肿瘤干细胞特性 在胰腺癌中，利用RAN-Seq分析鉴定出非经典Wnt途径在胰腺癌中的作用，抑制Wnt2基因有可能抑制转移肿瘤可以通过CTC进行自我种植（self-seeding），进而促进肿瘤增大，血管生成等,26,1. Nat Biotechnol. 2014 May;32(5):479-842. Nat Biotechnol. 2013 Jun;31(6):539-443. Nature. 2012 Jul 26;487(7408):510-34. Cell. 2009 Dec 24;139(7):1315-26,CTC：肿瘤转移机制,27,胰腺癌CT
14、C的RNA-Seq 分析发现：CTC高度表达间质来源的 胞外基质蛋白SPARC促进胰腺癌的转移,前列腺癌CTC的RNA-Seq分析发现CTC中的相关信号通路,1. Cell Rep. 2014 Sep 25;8(6):1905-182. Science. 2015 Sep 18;349(6254):1351-6,CTC cluster,在乳腺癌中，CTC cluster 转移能力大约是单个CTC的50倍， plakoglobin(斑珠蛋白)在形成中其关键作用，表达降低后肿瘤转移能力显著下降CTC cluster与血小板、白细胞、成纤维细胞及内皮细胞共同构成特有微环境，可以抑制失巢凋亡CTC c
15、luster提示患者预后较差,28,1. Cell. 2014 Aug 28;158(5):1110-222. Trends in Cancer, 2015, 1(1): 44-52,ctDNA：临床应用前景广泛,29,早期诊断，检测残余病灶,动态监测治疗反应；指导靶向用药,判断预后,Clin Chem. 2015 Jan;61(1):112-23,ctDNA：检测方法日新月异,30,数字PCR计数提高稀有突变检出率，提高检测的深度NGS计数可以性检测多个靶基因，尤其是靶向深度测序，提高检测广度,J Clin Oncol. 2014 Feb 20; 32(6): 579586,Kras基因为胰
16、腺癌重要驱动基因,31,Trends in biochemical sciences, 2014, 39(2): 91-100,液体活检检测KRAS对PC预后有更强的判断能力,32,Med Oncol(2016)33:61 DOI 10.1007/s12032-016-0777-1,ddPCR检测ctDNA,105例PDAC手术患者，肿瘤组织KRAS突变率82%，ctDNA 突变率33%，与肿瘤在组织符合率100%肿瘤组织KRAS突变无判断预后作用（P=0.18），ctDNA的KRAS突变可判断预后（13.6月 vs 27.6月，P0.001）不同KRAS突变亚型的患者OS无显著差别,33,B
17、r J Cancer. 2016 Jun 28;115(1):59-65,ctDNA动态监测病情变化,ctDNA与CA19-9水平有 很好的相关性(Spearmans rho=0.786, P=0.021)ctDNA较影像学平均提前 6.5月发现肿瘤进展,34,Mol Oncol. 2016 Apr;10(4):635-43Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686,ctDNA指导靶向用药,35,Sci Rep. 2015 Dec 16;5:18425Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686,ctDNA反映胰腺癌突变基因类型，可使更多患者有可能得到靶向治疗大约
18、三分之一患者有可用靶向药,胰腺癌靶向深度测序Panel,36,基于ctDNA的靶向用药结果,EGFR外显子19缺失与厄洛替尼敏感有关ctDNA提前检测到该突变，后经活检证实，予以厄洛替尼治疗结果CA19-9正常，肿瘤缩小，病情缓解,37,Cancer Discov. 2015 Oct;5(10):1040-8,基于ctDNA的靶向药物试验,BRAF V600E突变在胰腺癌中比例3%，不与KRAS突变共存，是Vemurafenib批准用于治疗黑色素瘤的靶点取BRAF V600E突变患者肿瘤细胞进行培养，结果发现和黑素偶细胞系MNT-1对Vemurafenib有类似敏感性，而KRAS突变细胞系PL
19、-45则无反应,38,Nat Commun. 2015 Apr 9;6:6744,世界范围内的精准医疗热潮,澳大利亚针对晚期胰腺癌患者进行The Individualized Molecular Pancreatic Cancer Therapy (IMPaCT) 试验， 帅选出HER2 扩增; KRAS野生型; DNA修复通路基因突变 (BRCA1, BRCA2,PALB2, ATM)患者进行靶向治疗，有可能通过液体活检辅助精准靶向治疗美国NCI正在组织进行MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice) 试验，计划帅选3000名实体肿瘤患者，最终根
20、据突变类型给予靶向药物治疗,39,Clin Cancer Res. 2015 May 1;21(9):2029-37Semin Oncol. 2014 Jun;41(3):297-9,我们开展的研究,40,部分检测结果,41,Sanger法,ddPCR法,部分检测结果,42,ARMS法,外泌体组成,43,外泌体是一种直径为 30 100 nm 的膜性小囊泡，可由机体中的多种细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆和乳汁等体液中。相关研究登记在http:/www.exocarta.org/,Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:255-89,外泌体分离方法,离心法：收集细胞培养
21、液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体过滤离心：利用不同截留相对分子质量 (MWCO)的超滤膜离心分离外泌体密度梯度离心：将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法免疫磁珠：包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合色谱法：利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法,44,胰腺癌外泌体研究Landmark,45,德克萨斯大学M. D.安德森癌症中心,外泌体早期诊断,46,PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程，4.5
22、周时形成PanIN，8周时死于PDACGPC1+ 外泌体的比例随着肿瘤体积增大和组织学分化变差而不断升高外泌体的浓度与大小同样与病情进展相关系较差外泌体含有KRAS突变且在胰腺癌早期阶段升高，可以作为理想的胰腺癌早期诊断标记物,Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82,外泌体用于胰腺癌诊断,47,GPC1+ 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰腺良性疾病和正常人群的灵敏度和特异度为100%。GPC1+ 外泌体比例对于不同分期（原位癌、和期肿瘤的灵敏度和特异度均为100%）外泌体浓度及大小无法有效鉴别,外泌体提示肿瘤负荷,48,28/29的PDAC和全部PCPL术后GP
23、C1+ 外泌体均下降19/29的PDAC和0个PCLC患者术后CA19-9水平下降,外泌体变化判断胰腺癌预后,49,GPC1+ 外泌体下降大于中位水平的OS和disease-specific survival 水平高于低于中位水平者（OS: 26.2月 vs 15.5 月; DSS: 27.7 月vs 15.5月）CA19-9水平现将无法判断预后,该项研究提出的问题,GPC1不是胰腺癌特有标记物，在乳腺癌中的表达为75%，如何能够与其他肝胆胰肿瘤鉴别需要进一步研究能否用于胰腺癌高危人群的筛选，如胰腺癌家族史，Peutz-Jeghers 综合征，慢性胰腺炎患者GPC1与CA19-9联合用于胰腺癌
24、诊疗效果如何外泌体检测过程需要简化和规范化,50,外泌体介导胰腺癌肝转移,51,外泌体抑制巨噬细胞游走,Kupffer细胞吞入外泌体后导致TGF-分泌,TGF-促进肝脏星形细胞产生纤连蛋白,促进巨噬细胞和粒细胞聚集到肝脏,肝转移形成,Nat Cell Biol. 2015 Jun;17(6):816-26,外泌体导致胰腺癌相关糖尿病,52,含有肾上腺髓质素的外泌体被细胞通过内吞或胞饮作用摄入肾上腺髓质素造成内质网应激和蛋白折叠障碍，抑制胰岛素分泌，导致细胞功能障碍最终死亡,Clin Cancer Res. 2015 Apr 1;21(7):1508-10Clin Cancer Res. 2015 Apr 1;21(7):1722-33,外泌体的深度测序,通过Illumina HiSeq 2500 sequencer对PDAC whole genome, exome and transcriptome sequencing，检测到CNV、点突变、InDel、融合基因等信息外泌体全外显子组测序覆盖95%99%靶基因，很好代表肿瘤DNA在外泌体DNA样本中检测到多个可治疗靶点，如NOTCH1 和BRCA2可以,53,Annals of Oncology 27: 635641, 2016,54,谢谢,
