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1、 2.天然产物的提取分离和结构鉴定, 2.1 天然产物化学成分的预试验与提取 天然产物化学成分的预试验天然产物化学成分的系统分离提取天然产物的常用方法天然产物的分离与精制,天然产物化学成分的预试验p11, 天然产物化学成分的预试验流程,2. 天然产物化学成分的系统分离p12, 天然产物化学成分的系统分离流程,3. 提取天然产物的常用方法溶剂提取法 水蒸气蒸馏法分馏法吸附法沉淀法盐析法透析法升华法,溶剂提取法即利用溶剂从天然产物中把所需要的成分溶解出来,而对其他成分则不溶或少溶。溶剂提取法是提取天然产物化学成分最常用的方法。,溶剂提取法,-水和油不相混溶,共存时分为两相,这一事实指出油和水基本上
2、是两个极端。其他化合物包括溶剂和天然产物化学成分的性质虽各不相同,但就其对水和油中的溶解行为来讲,也在这两个极端以内,亦即有的性质近于水,有的近于油。这种近于水的性质叫亲水性,近于油的性质叫做亲脂性。,选择溶剂的理论依据,-亲水性强的化合物在水中溶解度较大,亲脂性强的化合物在油中的溶解度较大。这种亲水性或亲脂性的强弱是和化合物的结构直接相关。简言之, 在多数情况下凡化合物与水的结构相似,就具有亲水性,与油脂的结构相似,就具有亲脂性。这就是所谓 “相似相溶”原则。,石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水,-天然产物化学成分亦可通过结构去估计它们的极性性质。例如：苷类的分子中结合糖分子,羟基数目多
3、,能表现出较强的亲水性,而苷元则属于亲脂性化合物。生物碱是亲脂性化合物,而生物碱的盐,能够离子化,加大了极性,就变成了亲水性化合物。鞣质(ru-zh)是多羟基的衍生物,列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素等,都是强亲脂性成分等等。,常见取代基的极性顺序： 烷烯醚酯醛酮醇醇酚酸-“相似相溶” 只是一条经验规律,它虽然可以解释一些溶解现象和帮助选择溶剂,但它的“相似”概念是比较含糊的。若从溶剂分子与溶质分子间相互作用力出发,则可使这一概念较为清晰。,提取溶剂的选择主要根据溶剂的极性和被提取成分及其共存杂质的性质来决定,同时应考虑价廉、安全、浓缩方便等问题。溶剂的极性常以介电常数 (Eps
4、ilon)来表示。溶剂的极性是和它们的亲脂性和亲水性相当的。一般可分为三类：（1）水：是典型的强极性溶剂(=80)。亲水性成分,如生物碱、苷类、有机酸盐、鞣质、蛋白质、糖类及无机盐等都被提出。,溶剂的选择,（2）亲脂性有机溶剂：如石油醚、苯、乙醚、氯仿等小的溶剂属于这一类，可提取亲脂性成分,如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、植物甾醇、内酯、某些生物碱及某些苷元（如甾体苷元、黄酮、蒽醌等）。,zi,（3）亲水性有机溶剂：主要是甲醇、乙醇、丙酮等,具有较大的介电常数（约为 1030）,它们能溶于水,又能诱导非极性物质产生一定的偶极距( 即产生一定的极性),而使后者的溶解度增加,如乙醇分子可极化苯分子,
5、故苯能溶于乙醇中。由于极性有机溶剂有这些性质,所以它们对各类成分的溶解性能好,对细胞的穿透力也较强,提取成分比较全面。,浸渍法：此法简单,可将天然产物粗粉装入适当的容器中,加入合适的溶剂,以能浸透药材稍有过量为度,放置一日以上过滤,浓缩后可得到提取物。 渗漉法：在渗漉筒中进行,也比较简单易行。 煎煮法：是将天然产物粗粉加水加热煮沸,将有效成分提取出来的方法。 回流提取法：用有机溶剂提取时采用加回流装置,以免溶剂挥发损失。 连续提取法：在实验室内一般采用索氏提取器来完成,提取效率高，但提取时间长。,提取方法,l,茶叶中含咖啡因约15%，另外还含有1112%的丹宁酸（鞣酸），0.6%的色素、纤维素
6、、蛋白质等。用适当溶剂（如乙醇等）在索氏提取器中连续萃取，然后蒸去溶剂，即得咖啡因粗品。,在选定好合适的溶剂的前提下,下列因素可影响提取效率：(1) 粉碎度 (2) 温度(3) 时间,影响提取的因素,-水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性的,能随水蒸气蒸馏不被破坏,与水不发生反应,而且难溶或不溶于水的成分的提取。,水蒸气蒸馏法,在一般情况下,中药提取液经浓缩后得到的浓缩物仍是混合物,尚需进一步去杂质,进行分离纯化（精制）。,4. 天然产物的分离与精制,根据溶解度不同进行分离根据两项溶剂中的分配比不同进行分离根据吸附性差别进行分离根据分子大小差别进行分离根据解离程度不同进行分离,结晶、重结晶法 沉淀法
7、（溶剂沉淀法） 酸溶碱沉法-提取生物碱 金属盐沉淀法（盐析法）,(1) 根据溶解度不同进行分离,结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一,是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法。 具体操作是选用合适的溶剂, 将混合物加热溶解, 形成有效成分的饱和溶液, 乘热滤去不溶的杂质, 滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置, 使有效成分大部分析出结晶, 由于初析出的结晶总会带一些杂质, 因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法, 才能得到高纯度的晶体。,结晶法,沉淀法是在提取液中加入某些试剂使产生沉淀,以获得有效成分或除去杂质的方法。 例如：水提醇沉法沉淀多糖,沉淀法,盐析法是在水提液中
8、,加入无机盐至一定浓度,或达到饱和状态,可使某些成分在水中的溶解度降低而沉淀析出,从而与水溶性大的杂质分离。 常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 例如自黄藤中提取掌叶防己碱, 自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。 有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大, 在萃取时, 亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐, 再用有机溶剂萃取。,盐析法,液液萃取与分配系数 K值(p19) 分离难易与分离因子 (p19) 分配比与pH对酸碱两性化合物的影响（以酸性成分为例） 逆流分溶法CCD 液液萃取与PC 液液分配柱色谱 液滴逆流色谱DCCC及高速逆流色谱HSCC
9、C,(2) 根据两相溶剂中的分配比不同进行分离,是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 混合物中各成分在两相溶剂中分配系数相差越大,则分离效率越高。 简单萃取通常在分液漏斗中进行。,简单萃取法,为克服使用分液漏斗多次萃取的操作麻烦,有人发明了连续萃取装置。这一仪器是利用两溶剂的比重不同自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。 此法简便且可避免乳化,由于两相呈动态逆流相遇,并经常能保持较大的浓度差,萃取过程能连续不断地进行,所以溶剂用量不多而萃取效率甚高。,连续萃取法,Higher-density solvent extraction,Low-densi
10、ty solution being extracted,Extraction solvent,Vapor,Boiling flask containing high-density extracting solvent and extracted solute,Diverter for drops of condensate of high-density solvent,Condensate,Reflux condenser,Heat,Lower-density solvent extraction,Heat,High-density solution being extracted,Ext
11、racting solvent,Condensate,当物质的分配系数接近时,则需要采用逆流分溶法进行分离。 这种方法是以分配定律为基础的一种新的分离方法,具有很强的分离混合物的能力。 但此方法因仪器易损,操作时间长, 消耗溶剂多等缺点,使用受到限制。,逆流分溶法CCD(counter current distribution),逆流分溶法采用数百个分离管进行操作，每一次操作后，上层液体被转移至盛有新的下层溶剂的分离管中，而往原分离管中加入新的上层溶剂，看起来好似两相的液体以相反的方向流动，故称为逆流分溶法。,此法又称液滴逆流层析法 原理与逆流分溶相似,但比后者效率高。,液滴逆流分配法DCCC
12、(drop counter current chromatography),影响液滴逆流分配的主要因素有： 被分离成分在两相溶剂间的分配系数要大； 形成大小合适的移动相液滴，这与两相间的界面张力、密度差、输液管口径和萃取管材料等有关，可以采用数根萃取管预试液滴的形成情况而确定； 液滴间的间隔，与泵的送液速度有关，送液速度过快，液滴间几无间隔变成线流通过固定相，通常也可经过小样探索而定。,液滴逆流分配法的分离效果往往比逆流分溶法好，且不会产生乳化现象。移动相用氮气驱动，被分离物质不会因遇空气中氧而氧化。应用该法曾满意地分离纯化多种成分，如皂苷、生物碱、蛋白质、多肽、氨基酸及糖类等。,吸附规律 极
13、性及其强弱判断 吸附柱色谱 聚酰胺吸附色谱法 大孔树脂,(3) 根据物质的吸附性差别进行分离,极性吸附剂：硅胶、氧化铝 非极性吸附剂：活性炭,吸附规律（P21）,官能团的极性 酸性及碱性化合物 溶剂极性,极性及其强弱判断,硅胶、氧化铝 装柱方法 洗脱溶剂,吸附柱色谱,氢键吸附 吸附规律（P23） 脱鞣质处理,聚酰胺吸附色谱法,吸附性与分子筛原理相结合的分离材料 非极性和极性 应用广泛,大孔吸附树脂,大孔吸附树脂（macroporous absorption resin）属于功能高分子材料，是近30余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂，是吸附树脂的一种，由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂
14、经聚合反应制备而成。 聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。 因此大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在1001000nm之间，故称为大孔吸附树脂。,大孔吸附树脂,表面积较大，且交换速度较快 机械强度高 抗污染能力强，可重复使用 理化性质稳定，热稳定好 在水溶液和非水溶液中都能使用,大孔吸附树脂优势,凝胶色谱 size exclusion chromatography gel chromatography 葡聚糖凝胶：Sephadex G, Sephadex-LH 20,(4) 根据物质的分子大小差别进行分离,尺寸排阻色谱法,离子
15、交换法分离物质的原理 离子交换树脂的结构与性质 离子交换法的应用,(5)根据解离程度不同进行分离,2.2 色谱分离分析方法 纸色谱法 薄层色谱法 柱色谱法 快速柱色谱法 真空液相色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法,快速柱色谱法P29，图2-9,2.3 结晶和重结晶 结晶的条件 结晶溶剂的选择 制备结晶的方法 不易结晶或非晶体化合物的处理 结晶纯度的判断,2.4 天然产物化学成分的结构鉴定-天然产物化学成分经过提取、分离、精制成为单体化合物后,必须进行鉴定,确定其化学结构,才有可能为人工合成、结构改造和药物设计等研究提供可靠的依据。因此,天然产物化学成分的鉴定工作,是本门学科的重要内容之一。,-
16、在证实所得到的中药化学成分为纯的单体之后,一般要进行熔点、沸点、比旋光度和折光率等物理常数的测定,然后再利用测得的物理常数查对有关文献手册可初步确定样品是已知物还是未知物。,物理常数的测定,一般的程序是先对化合物进行元素分析,测得各元素的百分含量,从而求出实验式。再根据分子量计算出分子式。 目前,高分辨质谱的分子离子峰可直接计算出分子式。,分子式的测定,知道分子式之后,根据缺氢因素,计算出双键的数目或环数,既不饱和度。 结合物理常数、化学定性试验、化学降解反应等以及 UV、IR、NMR 和 MS 数据综合分析,以确定化合物有哪些官能团,具有何种母核,属于那一类化合物等等。,化合物官能团和分子骨
17、架的推定,确定一个天然化合物的分子结构,是一项复杂的工作,涉及面广 确定一个化合物的结构,往往是化学工作、仪器分析、植物化学分类学及文献工作的互相配合、综合分析而获得的结果。 波谱分析技术已成为测定天然产物化学成分结构必不可缺的手段。,化合物结构式的确定,凡具有不饱和键的化合物, 特别是存在共轭不饱和键的化合物, 在紫外光谱中可以见到特征吸收峰, 故紫外光谱适用于鉴定不饱和键的有无, 或用以推测这些不饱和键是否共轭。 单独从紫外光谱往往无法独立解决一个化合物的结构问题, 必须与红外光谱、质谱、核磁共振谱以及其他化学的和物理的方法互相配合, 才能得出 可靠的结论。,光谱测定和解析紫外可见吸收光谱
18、,红外光谱因能充分反映官能团与波长的关系，故对确定未知物的结构非常有用。 由于在指纹区不同物质的红外光谱完全不同，故对物质的鉴定也起着重要的作用。 特征频率区 指纹区特征,光谱测定和解析-IR（红外光谱）法,质谱是记录分析样品在质谱仪中经高温(300)气化, 气态分子受一定能量冲击, 失去电子, 生成阳离子, 而后在稳定磁场中按质荷比(m/z) 顺序进行分离, 通过检测器而记录的图谱。每个峰代表一个质量数。 用质谱来测定分子式和分子量是目前最快速和准确的方法,同时也是研究有机分子结构强有力的工具之一。,光谱测定和解析-MS(质谱)法,1H-NMR（氢谱） 提供分子中1H的数目、类型及化学环境，化学位移 0-19 ppm,诱导效应共轭效应各向异性氢键和质子快速的交换反应,光谱测定和解析核磁共振谱,delta,偶合常数的表示 各类偶合常数 氢谱解析,偶合常数 J (Hz),13C-NMR （碳谱）-化学位移范围 0250 ppm,解析 全去偶谱偏共振去偶谱（伯、仲、叔、季）常见官能团 C的值,提取和分离方法的原理及规律 常用溶剂的极性顺序 硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、离子交换树脂、大孔树脂法及分配层析等层析分离方法的规律 不饱和度的计算 熟悉UV、IR、MS、NMR四大光谱法的鉴定天然化合物的原理及方法 了解结构研究的主要程序和结构研究中采用的主要方法,本章重点,
