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1、定性免疫学检验的性能验证与质量控制,定性免疫学检验的性能验证与质量控制,CNAS-CL39：2012医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明： 检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比对），精密度（包括重复性和批间精密度）；并应明确检验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。,一、定性免疫试验的性能验证,一、定性免疫试验的性能验证,筛查试验诊断试验确认实验C50C5C95,性能验证相关概念,性能验证相关概念,一份样本，在多次重复实验中各有50%
2、的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。对特定试剂， C50一旦确定，是恒定不变的。,临界点（C50）浓度的定义,C50,临界点（C50）浓度的定义C50,一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性结果时该分析物的浓度。,C5 浓度的定义,C5,C5 浓度的定义C5,一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性结果时该分析物的浓度。,C95 浓度的定义,C95,C95 浓度的定义C95,质控品：商用或自备，含阳性和阴性。C50和C5（C50-20%）及C95（C50+20%）浓度样本：用于重复性及最低检出限验证，不少于40次检测量。临床样本或血清盘：用于准确性验证，不少于50份阳
3、性和阴性样本。,性能验证的样本准备,性能验证的样本准备,纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。量值化定性试验：以COI（cut-off Index）或S/CO比值作为分析方法的精密度评价指标。,（一）不精密度的验证,（一）不精密度的验证,定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围C5020%。,纯定性测定不精密度的评估方法,纯定性测定不精密度的评估方法,分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线,分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线,两种不同方法的不精密度曲线比较,两种不同方法的不精密度曲线比
4、较,检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度，这一稀释度的分析物浓度即为临界点（C50）。,如何获得 “临界点（C50）”,如何获得 “临界点（C50）”,制备评价用样本 制备3份样本：一份浓度为C50，一份为C50+20%，一份为C50-20%。 每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的需要。评价方法 每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。,纯定性试验不精密度评价步骤,纯定性试验不精密度评价步骤,-20%+20%浓度范围在C
5、5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果不一致；此结论错误率5% ，需使用更宽浓度范围的样本（如30%）进行另外的试验。,不精密度评价结果判断-1,不精密度评价结果判断-1,-20%+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果一致,不精密度评价结果判断-2,-20%+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检,用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。,不精密度评价结果判断-3,用该方法检测，C50+20%
6、的样本检测结果一致，C50-20,12s警告，13s和22s失控。频次：ELISA应每板做质控。操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的可靠和稳定。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。TP+FP+FN+TN有效期一般可标定为1年。评价方法 每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。数值化定性试验的质控要求特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果一致处理措施：一次性吸头的使用，洗板机的维护，洗液的定期更换，温育温度和温育时间的保证，加样器及酶标仪的校准，荧光显微镜的维
7、护等。（d） 判定标准：应有80%的结果符合要求；如何获得 “临界点（C50）”ELISA的批内变异CV%应10%。如果采用手工操作或同一项目使用两套以上检测系统时.= 真阴性/（真阴性+假阴性）100%待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；,用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+
8、30%）进行补充试验。,不精密度评价结果判断-4,12s警告，13s和22s失控。用该方法检测，C50-20%,有些定性免疫测定，如ELISA等，样本的测定结果可以COI（cut-off Index）或S/CO比值来表示，检测系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。分为批内精密度评估和批间精密度评估,数值化定性免疫测定的精密度评价方法,有些定性免疫测定，如ELISA等，样本的测定结果可以COI（,操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的可靠和稳定。用
9、于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的血清(浆)样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品物质，如校准品或质控品。,精密度评估的基本原则（1）,精密度评估的基本原则（1）,评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精密度。所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为接近临界水平的浓度。,精密度评估的基本原则（2）,精密度评估的基本原则（2）,评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内重复进行至少20次检测，计算所得S/CO值的均值和SD，计算批内CV%。质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。判断结论
10、：应试剂说明书所标明的批内变异。ELISA的批内变异CV%应10%。,批内精密度的评估,批内精密度的评估,评估方法：三个不同浓度的样本，在10天以上时间内单次重复进行至少20批检测，计算所得S/CO值的均值和SD，计算批间CV%。质量控制：判断结论：应试剂说明书所标明的批间变异。 ELISA的批间变异CV%应15%。,批间精密度的评估,批间精密度的评估,检测限（limit of detection）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower limit of detection）或最小检出浓度（minimum detectable concentration），有时也称为分
11、析灵敏度（analytical sensitivity）。如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以测出的最低被测量浓度。,（二）检出限的验证,（二）检出限的验证,样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本。验证方法：处于测定下限浓度（C95）的样本，重复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。,检出限的验证方法,检出限的验
12、证方法,验证方法及指标： 以与临床诊断、金标准方法和标准血清盘的检测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符合率来表示。,（三）准确度验证,（三）准确度验证,临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现阳性结果和确定患者患病）。临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。,临床特异性和临床敏感性,临床特异性和临床敏感性,基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。如何获得 “临界点（C50）”如：抗ENA抗体谱检测不精密度
13、评价结果判断-4= 真阴性/（真阴性+假阴性）100%作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%；评价方法 每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。，应至少每年1次进行实验室内部比对，包括人员和不同方法/检测系统间的比对，至少选择2份阴性标本(至少1份其它标志物阳性的标本)、3份阳性标本(至少含弱阳性2份)进行比对，评价比对结果的可接受性。纯定性试验不精密度评价步骤FP分析物不存在时结果为阳性的数量。检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。精密度评估的基本原则（2）制备评价用样本 制备3份样本：一份浓度为C50，一份为C50+20%，一份为C50-20%
14、。室温：CV值、累计CV值，稳定期以与临床诊断、金标准方法和标准血清盘的检测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符合率来表示。每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。TN分析物不存在时检测结果为阴性的数量。如何获得 “临界点（C50）”分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。,阳性预测值：即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。 =真阳性/（真阳性+假阳性）100%阴性预测值:则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。 = 真阴性/（真阴
15、性+假阴性）100%,阳性预测值和阴性预测值,基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的,敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算,试剂的检测结果共计分析物阳性分析物阴性阳性结果数TPFPT,作为筛查试验，检测的敏感性应95%；作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%；作为确认试验特异性应98%-99%。,定性免疫检验项目敏感性、特异性要求,定性免疫检验项目敏感性、特异性要求,如果没有可用的诊断标准，那么需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试剂
16、和已验证方法的一致性程度。,阳性符合率和阴性符合率,阳性符合率和阴性符合率,待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算,阳性符合率和阴性符合率的计算,阳性符合率= a/(a+c) 100%。阴性符合率= d/(b+d) 100%。 总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。,待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算,第三方质控品检测系统配套质控品自制质控品,质控品的来源,二、检验结果质量的保证-室内质控,质控品的来源二、检验结果质量的保证-室内质控,基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。稀释液也应用
17、人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。稳定性：有效期为6个月以上,实验室应对有效期进行验证。,质控物的选择,基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的,质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控(高值阳性血清只用于监控“HOOK效应”)。检测位置不能固定而应随机放置。试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT OFF值及有效性判断标准，只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。,质控物的选择,质控物的选择,阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为ELISA质控
18、品浓度宜0.5倍临界值左右）阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物ANA 1:1000anti-dsDNA 1:100或以上anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性,质控物的选择,质控物的选择,弱阳性质控品：ELISA：临界值24倍的样本IIF:比临界值高1个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。ANA ：1：1001:320 ，ANA荧光模型：均质型，颗粒型，核仁型，或胞浆型等（可以每6个月变换，存储质控品至少有2个模型）anti-dsDNA：1:101:32anti-ENA：低度阳性或临界值24倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）,质控物的选择,质控
19、物的选择,ELISA的批内变异CV%应10%。阴性质控品的检测结果为阴性ELISA：临界值24倍的样本定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围C5020%。纯定性试验：如免疫印迹、免疫金标等，除膜条本身的内对照外：阳性预测值：即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。anti-ENA：低度阳性或临界值24倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）12s警告，13s和22s失控。需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的需要。阳性预测值和阴性预测值T
20、P分析物存在时检测结果为阳性的数量。，应至少每年1次进行实验室内部比对，包括人员和不同方法/检测系统间的比对，至少选择2份阴性标本(至少1份其它标志物阳性的标本)、3份阳性标本(至少含弱阳性2份)进行比对，评价比对结果的可接受性。作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%；稳定性：有效期为6个月以上,实验室应对有效期进行验证。用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致结果；纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。作为筛查试验，检测的敏感性应95%；每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性
21、质控品两个水平进行质控。,1 收集阳性血清(无明显溶血、黄疸、脂血及污染血清)到一定量（至少够本室使用6个月以上）；2 传染性病原体需经56、10小时灭活后使用；3 0.2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4 稀释：用正常人血清稀释；5 定值：与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2- 4倍Cut Off值附近的阳性值；6 分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20冻存备用；7 稳定性及瓶间差评价。,自制质控品,ELISA的批内变异CV%应10%。1 收集阳性血清(无明,不同保存条件下： 2-8：CV值（滴度符合率）、累计CV值（符合率），稳定期 -70：CV值、累计CV值，稳定期 室
22、温：CV值、累计CV值，稳定期1）均一性评估：同批号质控品随机抽取5支（瓶），80%符合为合格。2）稳定性评估：评估1周，1月，3月，6月，1年。有效期一般可标定为1年。,质控品稳定性的评价,不同保存条件下：质控品稳定性的评价,纯定性试验：如免疫印迹、免疫金标等，除膜条本身的内对照外：每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。质控判定规则阴性质控品的检测结果为阴性弱阳性质控品的检测结果为弱阳性,纯定性试验的质控要求,如：抗ENA抗体谱检测,纯定性试验的质控要求如：抗ENA抗体谱检测,以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验等。每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质
23、控品两个水平进行质控。质控判定规则：阴性质控结果为阴性弱阳性质控结果在靶值上下一个滴度或稀释度,纯定性试验的质控要求,如：ANA、ANCA等,纯定性试验的质控要求如：ANA、ANCA等,用数值判定结果的试验：如ELISA等。浓度：弱阳性质控品浓度宜在24倍临界值左右，阴性质控品浓度宜0.5倍临界值左右（两个水平）。频次：ELISA应每板做质控。质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个系统误差规则。12s警告，13s和22s失控。,数值化定性试验的质控要求,用数值判定结果的试验：如ELISA等。数值化定性试验的质控要,发现问题分析问题产生的原因采取纠正措施加以改进，进而预防验证和追踪
24、避免同样的问题出现第二次！,失控原因分析及处理,发现问题失控原因分析及处理,阳性质控品失控的常见原因: 加样不准、温育时间不稳定、偶然误差。阴性质控品的常见失控原因：污染、洗板不干净、标本间的交叉污染。处理措施：一次性吸头的使用，洗板机的维护，洗液的定期更换，温育温度和温育时间的保证，加样器及酶标仪的校准，荧光显微镜的维护等。,失控原因分析及处理,失控原因分析及处理,对没有开展室间质评的检验项目，实验室应通过与其他至少2个以上实验室比对的方式判断检验结果的可接受性，并应满足如下要求：（a） 规定比对实验室的选择原则；（b） 样品数量：至少5份，包括阴性和阳性；（c） 频率：至少每年2次；（d）
25、 判定标准：应有80%的结果符合要求；（e） 结果不一致时，应分析不一致的原因，必要时，采取有效的纠正措施，并定期评价实验室间比对对其质量的改进作用，保留相应的记录。,三、 室间质评与实验室比对,对没有开展室间质评的检验项目，实验室应通过与其他至少2个以上,采取纠正措施加以改进，进而预防1）均一性评估：同批号质控品随机抽取5支（瓶），80%符合为合格。用数值判定结果的试验：如ELISA等。临界点（C50）浓度的定义出现不一致，应分析原因，并采取必要的纠正指施，及时评估纠正指施的有效性，有相应的记录。= 真阴性/（真阴性+假阴性）100%检测限（limit of detection）是指检测方法
26、可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower limit of detection）或最小检出浓度（minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏度（analytical sensitivity）。作为筛查试验，检测的敏感性应95%；不精密度评价结果判断-3作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%；FP分析物不存在时结果为阳性的数量。用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果一致不精密度评价结果判断-37 稳定性及瓶间差评价。TP分析物存在时检测结果为阳性的数量。定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围
27、C5020%。检测限（limit of detection）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower limit of detection）或最小检出浓度（minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏度（analytical sensitivity）。样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本。纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳
28、性样本来评价定性检测方法的不精密度。质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。,检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。如果采用手工操作或同一项目使用两套以上检测系统时.阳性符合率和阴性符合率anti-ENA：低度阳性或临界值24倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为接近临界水平的浓度。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控(高值阳性血清只用于监控“HOOK效应”
29、)。质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；采取纠正措施加以改进，进而预防纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；=真阳性/（真阳性+假阳性）100%阳性符合率和阴性符合率FP分析物不存在时结果为阳性的数量。评估方法：三个不同浓度的样本，在10天以上时间内单次重复进行至少20批检测，计算所得S/CO值的均值和SD，计算批间CV%。anti-ENA：低度阳性或临界值24
30、倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）定性免疫学检验的性能验证与质量控制ELISA的批内变异CV%应10%。,anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果一致=真阳性/（真阳性+假阳性）100%，应至少每年1次进行实验室内部比对，包括人员和不同方法/检测系统间的比对，至少选择2份阴性标本(至少1份其它标志物阳性的标本)、3份阳性标本(至少含弱阳性2份)进行比对，评价比对结果的可接受性。ELISA的批内变异CV%应10%。= 真阴性/（真阴性+假阴性）100%不精密度评价结果判断-2定性免疫学检验的性能验证与质量控制如
31、果没有可用的诊断标准，那么需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。纯定性测定不精密度的评估方法室温：CV值、累计CV值，稳定期定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围C5020%。如何获得 “临界点（C50）”12s警告，13s和22s失控。质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；如果采用手工操作或同一项目使用两套以上检测系统时.评价方法 每份样本检测40次
32、，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。基质：应尽量选择人血清基质，动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。,如果采用手工操作或同一项目使用两套以上检测系统时.，应至少每年1次进行实验室内部比对，包括人员和不同方法/检测系统间的比对，至少选择2份阴性标本(至少1份其它标志物阳性的标本)、3份阳性标本(至少含弱阳性2份)进行比对，评价比对结果的可接受性。出现不一致，应分析原因，并采取必要的纠正指施，及时评估纠正指施的有效性，有相应的记录。 比对记录应由实验室负责人审核并签字，并应保留至少2年。,实验室内部比对,采取纠正措施加以改进，进而预防检测试剂或系统的说明书可能会注,
