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1、 本科生毕业设计(论文)中文题目龙牙百合在组织培养过程中的酶谱分析 外文题目 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture 学号 0507040099 姓名 彭 静 学院生 命 科 学 学 院 专业生 物 科 学 指导教师 完成时间2009-4-30 江西师范大学教务处制目录摘 要1Abstract21 文献综述31.1龙牙百合的生物学特征及价值31.1.1龙牙百合的生物学特征31.1.2龙牙百合的价值31.2龙牙百合在组织培养过程中过氧化物酶活性变
2、化的研究现状31.3国内外同工酶研究现状及应用41.4 研究的目的和意义42 实验材料、主要仪器与试剂42.1实验材料52.2实验主要仪器52.3实验试剂53 实验方法53.1技术路线53.2培养基及培养条件53.3确定上样量63.4电泳64试验结果及分析84.1组织培养过程中龙牙百合生长与分化情况84.2过氧化物酶同工酶与龙牙百合生长分化的关系95讨论96对下一步工作的建议10参考文献11附图12致 谢15摘 要在组织培养过程中，为研究龙牙百合生长分化与过氧化物酶同工酶的关系，对龙牙百合进行组织培养并采用聚丙烯酰胺不连续体系盘状电泳(垂直管电泳)分离不同阶段过氧化物同工酶。结果：在龙牙百合生
3、长分化过程及不同组织过氧化物酶同工酶酶谱有很大差异，过氧化物酶同工酶酶谱可作为判别龙牙百合生长分化进程的依据。关键词：龙牙百合,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,过氧化物酶同工酶 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture PENG JingAbstractIn the process of the tissue culture, a study on the relationship between the growth and differentiat
4、ion and Peroxidase isozyme of Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was carried out . Tissue Culture for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was taken , To separate Peroxidase isozyme under different stages , the discontinuous system of discoid spolyacrylamide gel electrophoresis (vertical tub
5、e gel electrophoresis) was used. And the result showed that there was a great difference of map of peroxidase isoenzyme in the process of the growth and differentiation and among different tissues. The map may be as a basis for determination of the course of differentiation.Key words：LilumbrowniiF.E
6、 Browh Var virdum baker, polyacrylamide gel electrophoresis, Peroxidase isozyme1 文献综述1.1龙牙百合的生物学特征及价值1.1.1龙牙百合的生物学特征龙牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)为百合科百合属中能形成鳞茎的栽培品种, 多年生宿根草本植物。鳞茎近球形, 横茎24.5cm，鳞片披针形, 白色, 无节, 味淡不苦。根系由肉质根和纤维状根组成, 肉质根又叫“ 下盘根” , 着生于鳞茎下部；纤维状根又叫“上盘根” , 着生在鳞茎上部。叶散生, 倒披针形。花乳白色
7、有香气, 一般称白花百合。龙牙百合喜凉爽, 耐荫蔽, 喜湿润, 怕水涝, 10以上可以萌发生苗, 生长适温为1624, 土层深厚、PH值5.76.3。排水良好的砂质壤土最适宜生长1。龙牙百合以其干品瓣形肥大微弯，色泽洁白至宝黄，形似龙牙而著称。1.1.2龙牙百合的价值 龙牙百合是一类药食同源、有较高经济价值的特产蔬菜和药用植物。龙牙百合以鳞茎入药 ,为常用中药 ,也可供提取淀粉或食用。龙牙百合含多种氨基酸、蛋白质、淀粉、磷脂、百合苷 A、B等抗癌性植物碱及维生素 B1、B2等营养物质 ,具有润肺止咳、宁心安神、清热解毒等作用 ,性微寒、味甘 ,是目前市场走俏的药用保健食品2。具有养阴润肺止咳，
8、清心安神功用；主治阴虚燥咳，劳嗽咯血、肺瘘、虚热、烦噪惊悸、失眠、多梦等；有镇咳、平喘、祛痰、抗疲劳、镇静、催眠、提高免疫力，升高外周白细胞等药理作用。龙牙百合是最名贵的一种百合，它内含丰富的生物碱，蛋白质，矿质元素等，是食品中的珍品，由开其价格昂贵，被奉为贵族食品。近几年,我国百合产量增加较快,经济效益显著3。1.2龙牙百合在组织培养过程中过氧化物酶活性变化的研究现状在龙牙百合的组织培养过程中，植物过氧化物酶以其广泛存在和特殊的生物学意义而引起日益深入的研究4。龙牙百合组培过程中对过氧化物酶活性变化的研究和其他百合属植物一样，一般都是通过测定植物发育不同时期内的过氧化物酶活性变化规律,来研究
9、植物的组织分化状况5。过氧化物酶与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系6。在植物的代谢过程中它可以除去过多的H2O2，从而维持正常生理过程，避免了H2O2的毒害7。因此，研究过氧化物酶活性变化是非常必要。有许多公司、研究中心在过氧化物酶活性方面作了大量工作，并取得了较好的成就。1.3国内外同工酶研究现状及应用同工酶的研究得到了很大发展，同工酶在植物体内调节一定的代谢过程，因此，常被用于细胞分化、器官发生及个体发育过程中基因表达的研究，从同工酶的器官组织特异性也反映了基因表达的时空特异性。过氧化物同工酶在各种动物体内广泛存在9，而且在某些动物的不同器官组织内酶谱存在一定的差异。研究分化进程
10、及其与过氧化物酶同工酶的关系，可以进一步深入探索龙牙百合生长分化的基因表达差异，为龙牙百合生长分化调控提供理论指导。酶谱的变化已作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标10。而且由于同工酶是基因的产物，能直接反映基因的异同，易于观察研究，目前已作为一种分化遗传分化标志广泛地应用于发育生物学、群体依次学、医学、分类学等各个领域。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存11 12。但至今尚未见到有关龙牙百合生长分化状况与过氧化物同工酶关系的研究。1.4 研究的目的和意义1.4.1研究目的在组织培养过程中，过氧化物酶同工酶不断发生变化13
11、。通过比较不同阶段过氧化物同工酶谱的差异，来研究龙牙百合生长分化与过氧化物酶同工酶的关系。1.4.2研究意义作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的生长分化研究中有重要的意义。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的同工酶14，可以反映某一时期植物体内代谢的变化，研究分化进程及其与过氧化物酶同工酶的关系，可以进一步深入探索龙牙百合生长分化的基因表达差异，为龙牙百合生长分化调控提供理论指导15 16。2 实验材料、主要仪器与试剂2.1实验材料涂艺声教授细胞实验室培养的龙牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum bak
12、er)无菌苗。每隔10天对龙牙百合的茎段取一次样。2.2实验主要仪器垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）、稳压稳流直流电泳仪、高速冷冻离心机、电子分析天平2.3实验试剂见附表4 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法，但染色使用醋酸联苯胺染色。醋酸联苯胺染色：0.1g联苯胺+5ml无水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸钠+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的双蒸水。溶解并过滤待用。胶片用双蒸水冲洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶带完全出现后（约20min），用自来水冲洗2-3次，再隔一天换一次水，总共换2-3次。3 实验方法3.1技术路线本实验拟采取如下技
13、术路线：无菌苗外植体接种培养不连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶酶谱分析(定期观察龙牙百合的培养情况,看其生长势态，同时测定过氧化物和硝酸还原酶活性,做纪录)3.2培养基及培养条件本试验采用的基本培养基是MS培养基，其配方查阅有关的资料，另外附加6一BA、NAA植物激素。蔗糖分别为每升培养基30g，琼脂每升培养基 5.8 g，pH 为5.8 ，在容量为200ml的三角瓶中装入50ml，并以高压蒸汽灭菌锅 在118下灭菌25分钟，培养温度为(25+2),光照度为1500lx,光照12 h/d。 表1 2种培养基成分Table 3 culture medium ingredient培
14、养基编号培养基成分1号1/2MS基本培养基+BA 1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +20g/l 蔗糖2号1/2MS基本培养基+ BA1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +30 g/l 蔗糖3.3确定上样量 设置一系列量（ul）（5、7.5、10、12.5、15、17.5、20），点样在一块电泳板上，然后进行电泳，发现点样量为12.5ul和15ul的图谱最清晰，所以上样量确定为12.515ul.3.4电泳17参照参考文献13中聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶。用10倍pH8.3的Tris甘氨酸缓冲液，分离胶采用过硫酸铵TEMED催化系统，pH8.9，凝
15、胶总浓度T7.1%，浓缩胶采用核黄素TEMED催化系统，pH6.7、T3.1%，电极缓冲液为pH8.3Tris甘氨酸系统。加样量15ul，电泳在4度条件下进行，开始稳压为100v，指示剂溴酚蓝进入分离胶后恒压200v，电泳时间约一个半小时。3.4.1贮液配制按表2配制贮液。3.4.2电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形
16、成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中。3.4.3凝胶的制备将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。按表3比例配制分离胶将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖23mm的水层（或水饱和正丁醇），静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。按表4比例配制浓缩胶注：TEMED在灌胶前加。先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入
17、两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。（放在有灯光处聚合）3.4.4样品的制备称取龙牙百合茎部0.5 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以6000r/min离心15min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。3.4.5点样去掉胶套。用微量注射器（50L）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽1550L。点样时须小心，防止样品液的扩散。3.4.6电泳将电泳槽放入冰箱，接好电源线（前槽为负极）。打开电源开关，调节电流到100V(约50
18、min)左右，样品进入到分离胶后加大到200V，维持恒压。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约一个半小时。3.4.7剥胶取出电泳胶板，掀开玻璃，去掉浓缩胶。3.4.8染色、记录结果醋酸联苯胺染色：0.1g联苯胺+5ml无水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸钠+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的双蒸水。溶解并过滤待用。胶片用双蒸水冲洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶带完全出现后（约20min），用自来水冲洗2-3次，再隔一天换一次水，总共换2-3次。倒掉染色液，重新加入7的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或
19、照相。4试验结果及分析4.1组织培养过程中龙牙百合生长与分化情况 4.1.接种20天后生长分化情况接种20天后，小块近轴面基部稍有膨大、生长。4.1.2接种30天后生长分化情况接种30天后，无菌小鳞茎的获得。小块近轴面基部经过膨大、生长,成为小鳞茎,同时有生根现象,一般每一小块可产生23个小鳞茎。(附图1)4.1.3接种40天后生长分化情况接种40天后，在小鳞片基部出现小突起,以后长大。多数生长出细长叶片,造成小鳞茎不饱满;不抽生叶片的小鳞茎相对要肥厚。(附图2)4.1.4接种50天后生长分化情况接种50天后，小鳞片基部出现白色愈伤组织,表面出现许多圆形突起,这些突起中有一部分随愈伤组织发育为
20、次生小鳞茎。在鳞茎盘基部产生大量根系,形成一颗完整植株。(附图3)4.2过氧化物酶同工酶与龙牙百合生长分化的关系迁移率（Rf）= 酶带移动距离/指示剂移动距离。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶实验中，发现龙牙百合组织培养过程不同生长分化阶段出现不同的过氧化物酶酶谱。发现生长分化期龙牙百合茎段的POD同工酶（染色最深）且表达的酶谱条带最多。而生长分化前期龙牙百合茎段的POD同工酶的活性很低（染色最浅），且条带最少。在各酶带中，相对迁移率为0.188的酶带2为生长分化阶段的共有酶带。但随着分化进程的加深，会逐渐出现3条酶带，其相对迁移率分别为0.245、0.126、0.061，可作为判定生长
21、分化进程的特征带。在龙牙百合生长分化的未分化期酶带较弱或缺失，但随着花芽分化进程的加深而出现，酶活性也有所加强。说明组织培养过程中过氧化物酶同工酶的表达和活性与不同生长分化阶段有关。如图所示（附图4）。5讨论尽管目前对过氧化物酶的生理功能还认识不够，但根据其与植物生长发育及组织分化之间所表现的比较稳定的关系，可以用它作一般组织分化的指标之一。过氧化物酶普遍存在于高等植物并在植物的生长发育中起重要作用。过氧化物酶是遗传信息表达的较好标志，它的合成受一系列基因所调控。基因表达的时空差异决定了同工酶在细胞分化、组织器官的形成及个体发育中酶谱的某种变化和同工酶谱的器官和组织的特异性，也即同工酶的可变性
22、。本实验以龙牙百合的茎段为材料进行过氧化物酶同工酶分析发现，龙牙百合生长分化阶段过氧化物酶同工酶谱有明显差别，龙牙百合茎段生长分化期的过氧化物酶同工酶酶谱比生长分化期多3条酶带，表明利用过氧化物酶同工酶分析鉴别作一般组织分化的指标是可行的。因此，可以通过酶谱的变化判断龙牙百合生长分化的进程。经过对组织培养过程不同生长分化阶段的反复实验，得出不同的酶谱，可以初步认定生长分化的不同阶段，酶的种类与含量是时刻发生改变的。实验受如下因子的限制，所得出的结论仍需要进一步研究：仅试植物材料茎段，没有对其它不同部位进行实验，如叶子等。因实验时间所限，仅对过氧化物酶同工酶进行了分析，而未对其它同工酶如超氧化物
23、进行分析 。6对下一步工作的建议本试验只对过氧化物酶同工酶（POD）酶谱进行了分析，还应多对几种酶，如过氧化氢酶同工酶（CAT）、酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）等的酶谱进行生理指标分析,以便能更好地说明问题。参考文献1 夏镇澳.植物组织培养与农业J.植物生理学通讯,1995,31 (1):62-642 Zhuping Gu,Arditti J.et al.The effects of BA,2,4-Dand IAA on sboot-tip cultures of CymbidiumJ.Lindleyana,1987,2(2):88-903 Thomas J.Shcchen,Orchide.I
24、n introduction for flori-cultureJ.Roy A.Laraen,1980:133-1634 蒋小满,赵建萍,毕可华.“艾西丝”南瓜诱导生根过程中过氧化物酶活性及同工酶的研究J. 1998,18(3):397-4005 Anderson W.C Propagation of Rhododendrons by Tissue Culture:Part I.Development of a CultureMedium for Multiplication of ShootsJ.Proc.Intl.Plant Prop. Soc,1975,25:1291356 Wilbur
25、 C. Anderson A Revised Tissue Medium for Shoot Multiplication of RhododendronJ. Amer.Soc. Hort. Sci,1984,109(3):343-3477 于琼花,张有珍,周平.等天目龙牙百合嫩枝扦插繁育试验J.林业实用技术,2004,6:23-248 张志良,瞿伟菁.植物生理学实验指导M.北京,高等教育出版社,2007,129 李建武.生物化学实验原理和方法M.北京,北京大学出版社,1994,910 赵铭钦,王豹祥,邱立友.不同陈化时期的烟叶酶活性变化及其同工酶酶谱分析J.烟草科技,2006,3(34):5
26、2-6111 李建武.五味子花芽分化与过氧化物酶同工酶的关系研究M.北京,高等教育出版社，006,3(34):52-6112 王亚馥等.枸杞组织培养中过氧化物酶和可溶性蛋白质的变化,实验生物学报J,1998.22,1-513 Scandalios,J.G.:1964.J.Heredity,55:281-28514 陈石根,周润琦.过氧化物酶M,上海:复旦大学出版社,200215 张进仁.我国柑橘同工酶研究的进展J.中国柑橘,1990,19(3):20-2216 李合生,孙群,章文华.植物生理生化实验原理和技术M.北京:高等教育出版社,200017 唐锡华,潘国桢.高等植物胚胎的教育生物学研究-
27、,稻胚发育过程中过氧化物酶的活性、出现位置及其同工酶谱的变化规律J.植物生理学报,1983,(9):357-361附图图1 龙牙百合的生长情况Fig.1 Lilumbrownii F.E Browh Var virdum bakers Growth situation after 30 days图2 龙牙百合的生长情况Fig.2 Lilumbrownii F.E Browh Var virdum bakers Growth situation after 40 days图3 龙牙百合的生长情况Fig.3 Lilumbrownii F.E Browh Var virdum bakers Grow
28、th situation after 50 days1号：未分化阶段2号、3号：分化初期4号、5号：分化后期1号 2号 3号 4号 5号图4过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.4 the peroxidase enzyme isozyme polyacarylamide gel electrophore表2 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法序号试剂名称配制方法1分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液)取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。2浓缩胶缓冲液，pH6.7(pH6.7 Tris-HCl缓冲液)取48 mL
29、1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。(加入浓HCL40滴)3分离胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液)Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4保存。4浓缩胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液)Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4保存。510过硫酸铵溶液（Ap）10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。（1g浓于10ml）6四甲基乙二胺（TEMED）原液。7核黄素溶液核黄素4.0mg，无离子水溶解后定容至100m
30、L。8电极缓冲液，pH8.3(pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液)Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释10倍。940蔗糖溶液蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。10pH4.7乙酸缓冲液乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定容至1 000 mL。117乙酸溶液19.4 mL 36乙酸稀释至100 mL。12样品提取液，pH8.0(pH8.0 Tris-HCl缓冲液)Tris 12.1 g，加无离子水1 000 mL，以HCl调节pH至8.0130.5溴酚蓝溶液0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。
31、致 谢本人有幸师从涂艺声教授完成本科论文，本文是在她亲切关怀和精心指导下完成的。几个月来，在学术上和生活中她给了无微不至的关怀，我很好的掌握了组培的基本方法，并掌握了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测同工酶的基本原理和方法，使我受益匪浅，为我以后走上科研的道路打下了坚实的基础。她不但用严谨的治学态度和渊博的知识指导我完成论文，而且教我做人和处世的道理，鼓励我在实践中摸索。她丰富的教学和科研经验，诲人不倦的精神深深影响了我。值此论文完成之际，向涂艺声教授致以最诚挚的感谢！同时，还有生命科学学院多位老师和同学给予的帮助，我衷心感谢曾给予我帮助的老师和同学。摘 要1Abstract21 文献综述31.1龙牙百合的生物学特征及价值31.1.1龙牙百合的生物学特征31.1.2龙牙百合的价值31.2龙牙百合在组织培养过程中过氧化物酶活性变化的研究现状31.3国内外同工酶研究现状及应用41.4 研究的目的和意义错误！未定义书签。2 实验材料、主要仪器与试剂42.1实验材料52.2实验主要仪器52.3实验试剂53 实验方法53.1技术路线53.2培养基及培养条件53.3确定上样量63.4电泳64试验结果及分析84.1组织培养过程中龙牙百合生长与分化情况84.2过氧化物酶同工酶与龙牙百合生长分化的关系95讨论96对下一步工作的建议10参考文献11附图12致 谢15
