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1、化学发光免疫技术,第一节 发光与化学发光剂第二节 发光酶免疫测定（CLEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA)（chemiluminescence immunoassay） 第四章 电化学发光免疫测定技术(ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay),化学发光免疫技术：集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。,概 念,特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。,化学发光免疫技术的类型,按发光剂不同分为 1
2、.发光酶免疫测定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定,第一节 发光与化学发光剂,一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。,1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。,2.生物发光:
3、反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。,荧光素酶ATP；O2；Mg2+,氧化萤火虫荧光素,萤火虫荧光素,生物发光,返回,光 + AMP+ O2 + CO2 +,化学发光,机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。,二、化学发光剂,化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化
4、合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂,能参与化学发光反应； 与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； 应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。,化学发光剂应符合以下几个条件,返回,1.酶促反应的发光底物,是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物,1.1 鲁米诺,H2O2 /OH HRP,+N2 + H2O +光,对-羟基苯乙酸（HPA）,HPA在H2O2存在
5、下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。,1.2 HPA,H2O2HRP,+荧 光,氧化二聚体,AMPPD,AMPPD在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的 AMP-D阴离子，其有230min的分解半衰期，发 出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度 达到高峰，1560min内光强度保持相对稳定。,光,AP /OH HPO4 2,1.3 AMPPD,4-MUP,4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的 激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧 光光度计进行测量。,荧光,AP,1.4 4-MU
6、P,4-MU,360nm激发光,H3PO4 +,2.直接化学发光剂,特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）,+ CO2+ 光,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。特点：反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（TPA） 化学发光剂：三联毗啶钌,返回,三联毗啶钌分子结构图,第二节 发光酶免疫测定（CLEIA）,一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。,二、技术类型 根据
7、酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术,根据免疫学反应模式分 1.双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.固相抗原竞争法：,荧光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤弃上清,是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。,化学发光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤弃上清,是利用酶对发光底物催化作用而直接发光， 通过光强度的测定而直接进行定量。,电化学发光原理图,这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强,返回,激发态不稳定,基态,电极,1.抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时
8、间 后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗 体-抗原-酶标抗体复合物,技术要点,2.分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓 冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗 原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。,3.酶促发光反应 加入4-MUP，酶标抗体上AP将 4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光的照 射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大， 根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量,1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒,与标 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过 一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合 酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。,分离
9、技术,2.微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为 抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。,3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在 小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.,第三节 化学发光免疫测定技术（CLIA）,一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与 待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 检测进行定量或定性检测 。,二、技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分
10、离技术 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,1.抗原抗体结合反应 将包被McAb的磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测Ag与磁珠 上Ab结合，再加上AE标记Ab，经过温育，形成 磁珠Ab-Ag-AE标记Ab复合物。,技术要点,2.分离技术 在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快 地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。,3.化学发光反应 经洗涤的磁珠中，加入H2O2和 pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。,
11、1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催 化剂。,方法评价,2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量， 从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml。,3.AE标记试剂有效期长，可达一年。,4.固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被 面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更 简易、快捷。,第四节 电化学发光免疫测定技术（ECLI）,一、原理 是一种在电极表面由电化学引发的特 异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化 学发光二个过程。ECL是电启动发光反应，而CL 是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光 剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三
12、联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,二、技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,1.三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应,技术要点,2.将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次 孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合， 将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。,3.蠕动泵将形成的 Ru(bpy)32+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠 复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁 吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。,
13、4.蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。 该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子， 光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)32+的浓度呈 线性关系,故可测出待测Ag的含量。,原理图,返回,抗体包被 样本 Ru(byp)2+ TPA缓冲的磁珠 抗原 标记抗体 液洗涤,3,方法评价,标记物的再循环利用，使发光时间更长、强 度更高、易于测定；敏感度高，可达pgml或pmol水平；线性范围宽104；反应时间短，20min以内可完成测定；试剂稳定性好，25可保持一年以上。,五、临床应用,1.甲状腺激素 2.生殖激素3.肾上腺/垂体激素 4.贫血因子5.肿瘤标记物 6.感染性疾病7.糖尿病 8.心血管系统9.病毒标记物 10.骨代谢11.过敏性疾病 12.治疗药物监测,返回,
