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1、第八章 荧光免疫技术,第二节 荧光抗体技术一、标本的制作二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节 荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定,第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用思考题小结,第一节 概 述,荧光（fluorescence）,荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。,一、荧光的基本知识,发射光谱和激发光谱,发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用
2、不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。,荧光的基本知识,荧光效率,定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=,荧光的基本知识,荧光寿命,定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。,荧光的基本知识,荧光淬灭,定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（20）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。,荧光的基本知识,荧光偏振,FHFL PFHFL,荧光的基本知识,荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。,常用的荧光物质,二、荧光物质,第二节 荧光抗体技术,荧光抗体技术的基本原理
3、,荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。,荧光抗体技术的内容,荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查,抗体要求,高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG,一、荧光抗体的制备,有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。,荧
4、光素要求,荧光抗体的制备,抗体的荧光素标记,标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。,荧光抗体的制备,去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收,荧光抗体的纯化,荧光抗体的制备,荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验
5、、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释,荧光抗体的鉴定,荧光抗体的制备,-20：保存12年真空干燥：长期保存,荧光抗体的保存,荧光抗体的制备,组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞,标本的类型,二、标本的制作,冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。,组织切片的类型,标本的制作,固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保 存：4、-20,标本的固定和保存,标本的制作,直接法,直接荧光抗体染色法示意图,荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。
6、,三、荧光抗体染色及结果判断,间接法,特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。,间接荧光抗体染色法示意图,荧光抗体染色及结果判断,双标记法,两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。,荧光抗体染色及结果判断,设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型,荧光抗体染色结果判断,荧光抗体染色及结果判断,“-”：无或仅见极微弱荧光。“+”：荧光较弱但清楚可见。“+”：荧光明亮。“+”：耀眼强荧光。特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“”。根据呈+的血清最高稀释度判定
7、特异性抗体效价。,荧光抗体染色结果判断,荧光抗体染色及结果判断,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,四、荧光显微镜的基本结构,光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头,荧光显微镜,荧光显微镜的基本结构,隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。,荧光显微镜,滤光片,荧光显
8、微镜的基本结构,透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。,透射荧光显微镜光路(a),落射荧光显微镜光路(b),荧光显微镜,光路,荧光显微镜的基本结构,第三节 荧光免疫分析的类型,荧光免疫分析的基本原理,将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。,荧光抗体技术,荧光免疫测定,均相荧光免疫测定（homogeneous fluorescence immunoassay）,非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluoresce
9、nce immunoassay）,荧光免疫技术,荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。,荧光免疫技术的类型,荧光免疫测定的方法类型,非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定,自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长:10s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光,基本原理,时间分辨检测原理示意图,时间分辨,一、时间分辨荧光免疫测定,stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠,stokes位移,基
10、本原理,时间分辨荧光免疫测定,发射光谱带较窄：613nm10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm350nm，灵敏度高,基本原理,发射光谱和激发光谱,时间分辨荧光免疫测定,比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高,基本原理,荧光标记物的相对比活性,时间分辨荧光免疫测定,结合-二酮体,Eu3+解离,酸性增强液,荧光增强,Eu3+标记抗原抗体复合物,基本原理,信号增强,时间分辨荧光免疫测定,镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+),标记物,常见荧光物质的荧光寿命,时间分辨荧光免疫测定,标记方法,双功能螯合
11、剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）,标记方法：一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+,时间分辨荧光免疫测定,方法类型,双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法,时间分辨荧光免疫测定,方法类型,时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图,双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。,时间分辨荧光免疫测定,方法类型,固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体
12、竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。,时间分辨荧光免疫测定,方法类型,固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。,时间分辨荧光免疫测定,灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：45个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高,方法评价,时间分辨荧光免疫测定,光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。,偏振荧光(绿光,525nm550nm),偏振光(蓝光,485nm),荧光物质,基本原理,二、荧光
13、偏振免疫测定,抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比,荧光偏振免疫测定原理示意图,基本原理,荧光偏振免疫测定,方法评价,样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低,荧光偏振免疫测定,基本原理,荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图,碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。,三、荧光
14、酶免疫测定,酶和荧光底物,荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物,荧光酶免疫测定,方法类型,双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法,荧光酶免疫测定,方法类型,双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。,荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图,荧光酶免疫测定,方法类型,双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。,荧光酶免疫测定,方法类型,固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分
15、，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。,荧光酶免疫测定,方法评价,用酶和荧光底物的化学反应 作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相 荧光酶免疫测定效果好,荧光酶免疫测定,第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用,自身抗体检测,抗核抗体(均质型),抗核抗体(核膜型),抗核抗体(斑点型),一、荧光抗体技术的应用,病原体检测,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌),荧光抗体技术的应用,免疫病理检测,肿瘤（人肝癌细胞）,荧光抗体技术的应用,细胞表面抗原和受体检测,将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个
16、流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。,特殊应用：流式细胞分析,荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。,荧光抗体技术的应用,时间分辨荧光免疫测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等荧光偏振免疫测定：药物、维生素、激素、常规生化项目等荧光酶免疫测定：病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等,二、荧光免疫测定的应用,1荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？2常用的荧光物质有哪些？3荧光免疫技术有哪些类型？4荧光抗体技术的基本原理是什么？3什么是荧光抗体？如何制备、
17、纯化和鉴定荧光抗体？4荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？5荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型?,思考题,6时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型?7荧光偏振免疫测定的原理是什么？8荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型?9如何评价各种类型的荧光免疫测定？10荧光免疫测定有何应用？,思考题,荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应,在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测,分为直接法、间接法和双标记法等。荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相和非均相。,小 结,
