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1、华东理工大学 国家生化工程技术研究中心(上海)王永红2011.11.24,微生物菌种高通量筛选技术与装置,内容提纲,高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术与装备国际进展 高通量筛选技术应用示范,高通量筛选在微生物育种中的重要意义,1、菌种是发酵技术的源头2、菌种是发酵技术的核心之核心3、菌种提高不增加设备材料投入,菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现,青霉素：5万12万 u/ml（国内） 8万20万 u/ml（国外）红霉素：50008000/10000 u/ml（国内） 1000015000 u/ml（国外）阿维菌素：40008400 u/ml（国内） 10000 u/ml
2、以上（国外）,案例,育种工作中两大任务：突变与筛选,高通量筛选在微生物育种中的重要意义,突变仅是前提筛选才是关键,我国现有菌种筛选仪器装备与技术国际相比存在巨大差距 我国：传统方法，筛选方式半个世纪没有明显改进 国际：高通量筛选技术(High throughput screening, HTS),高通量筛选在微生物育种中的重要意义,内容提纲,高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术与装备国际进展高通量筛选技术应用示范,1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的发现56名科学家、10万份土样、历时1年25%市场1984年，Pfizer提出Automation Pro
3、ject.1990年，在Nagoya, Japan实施1万株份/周,高通量筛选技术的起源,微生物菌种筛选一般流程 概率事件,菌种高通量筛选技术与装备国际进展,通量限制步骤,微生物菌种筛选仪器装备发展趋势： 自动化、微型化、高通量培养基灭菌、分装；倒平板；挑取单菌落、接种；培养；目的产物抽提；测定；数据收集处理等过程 单元自动化与系统集成自动化（通量匹配）,菌种高通量筛选技术与装备国际进展,Filling Unit分装速率：400 - 1200 dishes/h分装量：4 - 45 ml/0.5 - 0.6 sec平动规格：直径92 - 98 mm可调高度15 - 21 mm可调灭菌方式：253
4、.7 nm 紫外线灭菌尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kgStacking Unit堆叠速率：可调，与输送机自动配合。 堆叠高度：2 - 15板平皿，可调堆叠桌面：500 500 mm可扩充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg,全自动培养基分装系统,750皿/小时,自动灭菌培养基制备机,出发株,诱变等,10倍稀释,涂平板,单菌落,初筛,复筛,工艺,放大,接种,倒平板,培养基,保藏,活化,前处理,检测,自动细菌平板稀释仪,4600个克隆/小时,培养,出发株,诱变等,10倍稀释,涂平板,单菌落,初筛,复筛,工艺,放大,接种,倒平板,
5、培养基,保藏,活化,前处理,检测,出发株,诱变等,10倍稀释,涂平板,单菌落,初筛,复筛,工艺,放大,接种,倒平板,培养基,保藏,活化,前处理,检测,培养基分装,传统方法,高通量方法：96、384、1536/min,传统方法：1-2/min（分光光度计）1/15-30min（HPLC）,出发株,诱变等,10倍稀释,涂平板,单菌落,初筛,复筛,验证,放大,接种,倒平板,培养基,保藏,活化,前处理,检测,培养基分装,1 微孔板式反应器2 微流控式芯片实验室3 摇瓶形式的微型反应器,1,2,3,2056 valves , 256 compartments containing bacterial e
6、xpressing an enzyme,24个，5ml,12个，30ml,24个，1ml,多通道多参数微型反应器,动物细胞培养用微型反应器,左图4.92.32.2 m，整个箱体有温湿度控制，箱体内，条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、光度计、离心机、冷藏室等。平行地实现样品准备、运行、监控768个（16个48孔板）。,系统集成自动化：四个层次,Orbitor工作站,重量轻only 55 lbs. 只有25公斤高可靠性Collision detection & recovery冲突检测与恢复Plate sensing in the gripper微孔板传感器Servo grippe
7、r does not drop a plate when the power goes out!伺服抓板手- 即使停电也不会让一个板子掉落运送一块板子只需4秒钟Bi-directional telescoping arm双向伸缩手Unlimited 3600 rotation无限360度转动No hard stops无急停死角Motion blending运动混合smooth movements平稳移动,Orbitor结构剖解,Bi-directional telescoping arm双向伸缩抓板手Rotating base旋转平台Internal re-grip内部固定装置Hotel mo
8、unt x4 板子堆栈*4,1.,4.,3.,2.,操作灵活性,PC driven微机控制No controller required无需其它控制装置Add-on storage capability可搭配存储能力Small footprint小的占地空间和轨迹Feed up to 4 instruments with ease可连接4台仪器Fits within a wide variety of bio safety cabinets适应多种型号的生物安全柜,内容提纲,高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术国际进展 高通量筛选技术应用示范,高通量筛选技术,Scale up,
9、Scale down,微型化,高通量,标准化,对高通量筛选技术存在认识上的误区,认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题；对操作条件的平行性没有足够的认识仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移问题对标准化重于最优化的认识不足高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段,菌种高通量筛选技术组成,菌种高通量筛选技术,通量匹配,限制瓶颈在不断克服和转移,菌种高通量筛选技术,菌种高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机整合和合理匹配,红霉素生产菌株的微型化培养及分析,微型化培养,就摇瓶与微孔板之间的生理发酵参数和动力学参数进行了研究，以证实微型化培养方法的可行性，为红霉素产生菌高通量筛选奠
10、定了基础。,微型化培养-动力学参数比较,2.1 氧气传递系数,2.2物料混合,流场特性,OTR 与混合,三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础,微型化培养-发酵参数比较,2.3 生物效价,2.4 总糖的对应性实验,微型化培养-发酵参数比较,2.5 还原糖的对应性实验,2.6生物量,微型化培养-装置图,种子（挖块）,发酵（孔径2cm）,微型化分析,建立与微型化发酵培养配套的检测方法，才能真正意义上实现筛选的高通量。生物检测法化学检测法,生物检测法,生物检定法又分管碟法和比浊法两种，管碟法是最常用的生物检定法，也是我国2005版之前药典收录的唯一一种微生物检定法。与管碟法比较，比浊法具有快速(检
11、验仅需34 h) 、易于操作、采用液体培养法、无扩散因素影响、灵敏度高和精密度较好等优点，适用于绝大部分抗生素和含抗生素样品的含量测定。,化学检测法,红霉素分子在酸性条件下水解生成黄色络合物，此颜色与含量成正比，符合朗格尔比色定律。,红霉素检测方法,微型化分析-生物检测法,微量比浊法测定红霉素生物效价的可行性,微型化分析-生物检测法,微型化分析-生物检测法,检验96孔板的准确度与精密度,微型化分析-化学检测法,红霉素化学效价测定结果比较,微型化分析-化学检测法,样品前处理对红霉素效价检测的影响分析,微型化分析-化学检测法,高通量化学检测方法验证,标准品加入法是在样品溶液中加入一系列梯度标准溶液
12、进行显色测定，然后按照绘制标准曲线的步骤测定吸光度,绘制吸光度-加入浓度曲线,用外推法求得样品溶液的浓度。两条直线切入横座标上所间的距离，即是样品中红霉素的化学效价，为47.8 /ml，标准曲线法测定的结果为48.02/ml，相对标准偏差为0.00324,Y1=0.0046X- 0.0164,Y2=0.0046X+0.2202,高通量（微型化）抗生素效价分析方法,生物效价高通量分析方法： 基于比浊法原理设计生物效价高通量分析方法，使分析时间从20多小时缩短到4小时，分析样品量从1ml降到10ul，鉴定菌培养基从30ml降到90ul，一次检测样品数量可达到成百上千份，而且仅需1人操作，传统生物效
13、价分析，每天每人分析样品数量50份左右。化学效价高通量分析方法： 开发了可以与自动化液体处理工作站相匹配的微量化化学分析路线，筛选通量更高，样品检测体积更小，反应体积从20ml降到500ul，检测体积从5ml降到100ul，分析时间更短，1小时之内完成上千份样品分析。,微型化平台应用,单菌落培养,高通量培养技术,装液量：500 2000 ul,24孔,48孔,96孔,固体培养和菌种保藏,可灭菌、重复使用寿命长、成本低、易清洗、能统一标准、防交叉污染、透气性好、防止水分蒸发,孔板盖,微孔板固定架,板数：882128,孔数：128243072 128486144 1289612288,多通道可调深
14、孔板取样适配器,专用菌落琼脂柱打孔器,微型化平台应用,对诱变后96个菌株分别进行摇瓶培养和微型化培养，5天后测定其生物活性，结果如图。,微型化平台应用,微型化平台应用,总结：高通量筛选技术的优势（1）,操作平行性 结果可比性 效率(一周到一个月完成常规方法一年的工作量) 成本：人力、时间、空间、经济,总结：高通量筛选技术的优势（2）,1. 高产菌株的筛选 数量性状：1多关系，无模型，依靠筛选数量 如：赖氨酸高产菌株筛选质量性状：01关系，有模型，无需庞大筛选数量。 如：赖氨酸缺陷菌株筛选其他：各种氨基酸、有机酸、维生素、抗生素、生物基产品等高产筛选,总结：高通量筛选技术的优势（3）,2. 发酵原材料（培养基）的生物检验直接检验原材料的应用效果精细调节原材料的配比和用量不同原材料与菌株的对应关系特点：建立原材料数据库和菌株数据库 长期性、基础性工作,谢谢！,
