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1、第七章 食品中兽药残留检验,第七章 食品中兽药残留检验,一、概述,典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是，随着集约化养殖生产的开展，一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂，也属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。兽药残留(residues of veterinary drug)是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。,一、概述典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是，,兽药最高残留限量(MRLVD)是指某种兽药在食物中或食
2、物表面产生的最高允许兽药残留量(单位gkg，以鲜重计)。兽药残留可分为7类：抗生素类;驱肠虫药类;生长促进剂类;抗原虫药类;灭锥虫药类;镇静剂类;-肾上腺素能受体阻断剂2002年农业部颁布动物性食品中最高残留限量规定：可用于食品动物，不需要制定最高残留量限量的药物有88种 可用于食品动物，需要制定最高残留限量的药物有94种 可以使用，但不得在动物性食品中检出兽药残留的药物有9种 禁止使用，且在动物性食品中不得检出的药物有31种,兽药最高残留限量(MRLVD)是指某种兽药在食物中或食物表面,兽药残留产生的原因,养殖环节用药不当是产生兽药残留的最主要原因。产生兽药残留的主要原因大致有以下几个方面
3、非法使用违禁或淘汰药物 不遵守休药期规定 滥用药物 违背有关标签的规定 屠宰前用药,兽药残留产生的原因 养殖环节用药不当是产生兽药残留的最主要原,兽药残留的危害,1.毒性作用：急、慢性中毒，致畸、致突变或致癌作用（简称“三致”作用）2.耐药性3.过敏反应4.激素样作用5.污染环境影响生态,兽药残留的危害1.毒性作用：急、慢性中毒，致畸、致突变或致癌,兽药残留分析技术,兽药残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术。残留分析既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏的痕量检测技术。样品分离纯化技术（提取和净化方法）的简单化、微型化和自动化，提高了提取或净化效率及自动化水平。如固相萃取法（SPE）、固相
4、微萃取（SPME），超临界流体萃取(SFE)、微波萃取法（MAE）、免疫亲和色谱（IAC）技术、基质固相分散（MSPD）技术，凝胶渗透色谱（GPC）净化，分子印迹技术等。在定量分析上的新技术包括毛细管电泳、超临界流体色谱、液相色谱-质谱联用技术、免疫分析技术和生物传感器等。,兽药残留分析技术兽药残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术,样本前处理,1.1提取 提取是使用适当溶剂将待测物连同部分样本基质从固态样本转至易于净化或分析的液态,通常可除去99%的样本杂质。根据样本的性质选择溶剂,如脂肪或水分含量。使用水溶性有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮等)有许多优点:溶剂和动物样本易混合,提取速度快;溶剂
5、溶解作用强;提取液pH值可以调节,适用范围广;提取的同时兼脱蛋白和脱脂;待测物在样本提取液中均匀分布,可只移取部分上清液或滤液进行分析,无需 反复提取将待测物全部转出。,样本前处理 1.1提取,1.2净化 净化即将待测物与提取液中的样本干扰杂质分离。兽药残留分析中常用的净化方法是液-液分配和固相萃取。液-液分配:等体积的分配体系中溶质分配平衡后溶解在非极性或极性较弱的溶剂中溶质的百分比称为p值,利用p值可以选择萃取系统、计算萃取次数和抽出率。通过调节溶液的pH值、极性、离子对形成等手段选择性地改变待测物的p值.固相萃取:其基本原理与开放式柱色谱相同。固相萃取中样本与微细颗粒填料(70150m)
6、接触面积大,净化速度快,分离效能高;操作简便,溶剂用量少,回收率高。薄层色谱:具有直观、速度快、样本容量大和分离效能高(颗粒3050 m)等优点。但对紫外-可见区无吸收的待测物却难以定位,有些待测物可通过标准品显色来解决。,1.2净化,1.3浓缩 浓缩是待测物富集或转溶的常用方法。前处理中以浓缩过程待测物损失最大。应避免样品液被直接蒸干,否则待测物可能附着于器皿上或与样本基质结合使回收率下降,高极性待测物如磺胺类药物较为严重。1.4衍生化 衍生化提高检测的灵敏度和选择性已成为残留分析中衍生化的最主要目的,如给待测物连接强电负性基团以适于气相色谱的电子捕获检测器检测、HPLC的紫外或荧光衍生化等
7、。,1.3浓缩,测定方法,气相色谱法：气相色谱法有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用,如氢焰离子化检测(FID)、氮磷检测器(NPD)等,检测限一般为g/kg级。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步骤,限制了GC的应用。,测定方法 气相色谱法：气相色谱法有许多高灵敏、通,几乎所有的化合物均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(510m),可重复进样,分析速度快。HPLC至今仍缺乏可满足兽药残留分析要求的通用型检测器。紫外检测器(UVD)最普及,其次是荧光检测器和电化学检测器。大部分抗生素在高于230 nm的光谱区无吸收,而在低于230 nm
8、的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰,需衍生化后测定,限制了紫外检测器的应用。(大多数动物源性食品中兽药残留分析采用HPLC法，但是对于某些兽药残留，HPLC的检出限达不到要求）,高效液相色谱法,几乎所有的化合物均可用HPLC进行测定。HPLC的分,HPTLC的出现使TLC进入了复兴时期,现已成为仅次于HPLC和GC的残留分析方法。HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(310m)。改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足,但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点,可使用正相或反相板,分辨率几乎与HPLC相当。HPTLC在兽药残留的快速筛选性检测方面应用广泛。,高效薄层色谱(H
9、PTLC),HPTLC的出现使TLC进入了复兴时期,现已成为仅次,超临界流体色谱(SFC),SFC可弥补GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器(MS,ECD等),如猪组织中磺胺类药物等抗菌素残留的SFC-MS分析。,超临界流体色谱(SFC),CZE是20世纪90 年代以来研究最活跃的分析技术之一。CZE不同于传统的凝胶电泳技术,CZE使用直径仅2550m的毛细管而不用载体,待测组分在高压(2030 kV)下泳动,截面积小,热量和泳速均匀。所以,CZE兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点,柱效高达106塔板/m。向电解质中加入超临界
10、胶束浓度的表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),即为毛细管胶束电动色谱(cap illarymi-cellarelectrokineticchromatography,CMEC),分离范围可扩展至中性或两性分子,分离效能亦进一步提高。CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小,限制了检测的灵敏度。,毛细管区域电泳(CZE),CZE是20世纪90 年代以来研究最活跃的分析技术,免疫分析技术,免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。兽药残留免疫分析方法的建立步骤包括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备和测
11、定方法建立免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法,都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。目前几乎所有重要的兽药已建立或试图建立免疫测定法(多数是ELISA),ELISA 缺点在于影响因素较多，易出现假阳性结果。,免疫分析技术 免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性,色谱-质谱连用技术,药物残留研究中，常用的色谱法具有高效的分离能力和高灵敏度的定量检测能力，但仅显示色谱峰和保留值，不能提供待测物残留组分的结构信息或对未知化合物进行结构鉴定。质谱等具有很强的结构鉴定能力，但只适用于纯物质的分析，自身不具备分离能力，两者结合特别是联用仪器可以集高效分离和结构鉴定于一体，是生物样
12、品复杂混合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。兽药多残留的IAC 分离纯化技术是LC-MS-MS 和GC-MS 检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物性食品中药物多残留的定量确证检测技术（IAC-GC-MS、IAC-LC-MS-MS），是残留分析研究领域的一个重要发展方向。,色谱-质谱连用技术 药物残留研究中，常用的色谱法具有,一.抗生素类药物,这类药物多为天然发酵产物，是临床应用最多的一类抗菌药物，如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应，四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间
13、内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等，极度超敏反应可能导致过敏性休克甚至死亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食品，可损害听力及肾脏功能。,一.抗生素类药物,四环素类,四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。广泛用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所致之感染。,四环素类 四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生,欧盟与中国关于四环素类抗生素的最大残留限量（GB/T5009.116-2003),欧盟与中国关于四环素类抗生素的最大残留限量（GB/T5009,氯霉素类抗生素,包括有氯霉素、甲砜霉素及无
14、味氯霉素等。（现已被禁用的氯霉素对哺乳动物的大肠杆菌病基本失去治疗作用，且能抑制蛋白质合成和骨髓造血功能，导致血小板减少性紫斑、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血和溶血性贫血。）检测见GB/T18932.19-2003,氯霉素类抗生素 包括有氯霉素、甲砜霉素及无味氯霉素等。,二.磺胺类药物,主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后，药物可不断在体内蓄积。磺胺类药主要经肾脏排出，在尿中浓度较高，其溶解度又较低，尤其当尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀胱内析出结晶
15、，产生刺激和阻塞，造成泌尿系统损伤，引起结晶尿、血尿、管型尿等。,二.磺胺类药物 主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧,三.硝基呋喃类药物,主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋喃类残留后，对人体造成的危害主要是胃肠反应和超敏反应。剂量过大或肾功能不全者，可引起严重毒性反应，主要表现为周围神经炎、嗜酸性白细胞增多、溶血性贫血等。长期摄人可引起不可逆性末端神经损害，如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等，中国和欧美大多数国家规定禁止使用此类兽药，在动物性食品和饲料中不得检出。,三.硝基呋喃类药物 主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃,盐酸克伦特仑残留的检验,一种平喘药
16、。该药物既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂.能够促进瘦肉生长抑制肥肉生长的饲料添加剂。理化特性：白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。检测方法GB/T 5009.192-2003,盐酸克伦特仑残留的检验 一种平喘药。该药物既不是兽药,四.抗寄生虫类药物,主要用于驱虫或杀虫，而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用残留有苯并咪唑类药物的动物性食品，对人主要的潜在危害是致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形，如短肢、兔唇等；对所有消费者来说，可能由于其致突变作用使消
17、费者发生癌变和性染色体畸变，从而其后代有发生畸形的危险。,四.抗寄生虫类药物 主要用于驱虫或杀虫，而常用的苯并咪,五.激素类药物,这类药物主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度，使用于动物的激素有性激素和皮质激素，而以性激素最常用，如孕酮、睾酮、雌二醇等。正常情况下，动物性食品中天然存在的性激素含量是很低的，因而不会干扰消费者的激素代谢和生理机能。但摄入性激素残留超标的动物性食品，可能会影响消费者的正常生理机能，并具有一定的致癌性，可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。,五.激素类药物 这类药物主要用于提高动物的繁殖和加快生长发,二.我国出口食品到国外检出问题：,90年输欧冻兔肉因
18、农残超标，被拒之门外，致出口量从7万吨锐减至2万吨90年出口日本的冻鸡肉，被检出克球酚残留，上万吨货在日本被扣留，国内库存上万吨货不能出口96年因残留监控和防疫体系方面的问题，欧盟从当年8月1日起禁止中国所有禽肉进口，直到2001年5月才对中国开放市场。受其波及，我国出口到日本的冻鸡腿出口价格从 2100/T降到1450/T,二.我国出口食品到国外检出问题：90年输欧冻兔肉因农残超标，,三、如何应对兽药残留,加快立法，健全兽药使用法规中华人民共和国商品检验法、食品卫生法、动物防疫法、兽药管理条例建立健全畜产品质量标准体系和药物残留监控、监测体系建设兽药安全监测信息网络加强药物残留检测工作大力推
19、广绿色畜产品生产技术加大对畜牧业相关行业的监察力度 提高基层兽医人员的业务素质大力宣传动物性食品兽药残留的危害性开展兽药残留国际合作与交流,三、如何应对兽药残留 加快立法，健全兽药使用法规,第七章食品中兽药残留检验课件,思考题,兽药、兽药残留动物性食品的概念是什么？动物性食品中主要的残留兽药有哪些？兽药残留的原因和危害有哪些？按残留分析目的，兽药残留检验的分析方法可以分为哪几类？GC法、HPLC 法、ELISA法和仪器联用等应用于兽药残留检验各有哪些优、缺点。色谱法测定残留兽药时，衍生化的作用是什么？液-液提取时加入氯化钠或硫酸钠等中性盐的作用是什么？,思考题兽药、兽药残留动物性食品的概念是什么？动物性食品中主,elements,elementswww.animationfactory.c,
