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1、上节课我们学了什么？,问题,生物反应器,生物反应器的一些概念生物反应器的基本类型,第二章 动物细胞大规模培养和专用生物反应器,学时：2节课主要内容：常用培养方法 动物细胞培养的操作方式 细胞培养过程的放大 动物细胞培养生物放大器,动物细胞培养开始于上世纪初1962年,其规模逐渐扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法(生产酶、生长因子、疫苗和单抗等)。,相关知识介绍,利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。,发展：在过去几十年来，从使用转瓶(roller bottle)、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor
2、）进行大规模细胞培养。,一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性三是难以对同批生产进行生产和质量控制。,第一代细胞培养技术核心问题：难以产业化！,随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。自70年代以来，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。80年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。,动物细胞大规模培养技术：（large-scale culture technolo
3、gy）定义：指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。,通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法,鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞人二倍体细胞cho（中华仓鼠卵巢）细胞BHK-21(仓鼠肾细胞)Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等。,可大规模培养的动物细胞,个性化培养基是胞细培养基的发展方向,图 8.1 细胞培养瓶,图 8.3 细胞工厂,Spinner培养系统,口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、及干扰素、血
4、纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子和、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。,目前已实现商业化的产品：,6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡,第一节 常用的培养方法,动物细胞生长特性：,1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素,2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差,3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌,4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）,5.培养过程产品分布细胞内外，成本高,非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。,依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类
5、：,贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。,“贴壁单核”细胞培养,贴壁的单核细胞,贴壁细胞,细胞培养的人参愈伤组织,知识回顾,一般步骤：,无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净,以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块,将小组织块置解离液（含蛋白酶类）离散细胞。,低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养,动物细胞培养步骤,植物细胞（组织）培养流程,悬浮细胞培养,提取纯化产物,脱分化：离体植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织（细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的
6、呈无定形状态的薄壁细胞）。,收集细胞,药物制剂,通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、人参皂甙等,大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,大规模培养动物细胞的方法：贴壁培养悬浮培养固定化培养,一、贴壁培养（attachment culture）,细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。1、生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培
7、养表面，并形成致密的细胞单层。,贴壁培养细胞转瓶机,2、贴壁培养的优点：容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。,灌注培养,3、贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比，扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；,4、细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。,5、贴
8、壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。,贴壁培养细胞转瓶机,细胞转瓶培养器,转瓶培养系统：为最初采用系统，一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。,转瓶机,转瓶培养的优、缺点,劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制。,优点：,结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等。,缺点：,二、悬浮培养（suspen
9、sion culture）指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基础上发展起来的。,小规模悬浮培养,悬浮培养瓶,用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的新方向。,无血清悬浮培养,三、固定化培养（immobilization culture）：,将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交
10、联法、包埋法、微囊法等。,1、吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。,2、共价贴附法:利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。,3、离子/共价交联法:双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交联作用，此
11、固定化细胞方法称为离子/共价交联法（cross-linking by covalent bonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。,4、包埋法:将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。,石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法,甲基丙烯酸甲酯包埋标本,微囊型包埋法,5、微囊法（microencapsulati
12、on）:用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400m为宜。,第二节 大规模培养技术的操作方式,深层培养可分为:分批式流加式半连续式连续式连续式灌注式,一、分批式培养（batch culture）较早期的方式，采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养 一次性收获细胞、产物、培养基。,特点:,操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小,直观反映细胞生长代谢的过程。,可直接放大。,细胞的生长分：延滞期、
13、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期五个阶段。分批培养的周期多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。,二、流加式培养（feeding culture）,细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/21/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。,1、流加培养物的方式 流加的时间通常在指
14、数生长后期，细胞进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次，凡是促细胞生长的物质均可以进行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分既不过剩而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。,2、流加工艺中的营养成分（三大类）：,葡萄糖：供能物质、碳源物质，浓度较高则产生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。谷氨酰胺：供能物质、氮源物质，需要控制浓度。大规模培养中细胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因。氨基酸、维生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些
15、特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。,三、半连续式培养（semi-continuous culture）,1、又称重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。,2、半连续式特点：培养物的体积逐步增加；可进行多次收获；细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。,优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的
16、水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。,四、连续式培养（continuous culture）,1、常见的悬浮培养模式：采用机械搅拌式生物反应器系统。在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基（防止衰退期出现）；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。,2、连续式培养的特点：细胞维持持续指数增长；产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。,连续式培养,3、优点：培养状态恒定，细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。在稳定状态下细胞所处的环境条件可维持不变（如营养物质浓度、产物浓度
17、、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率）。细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。,4、不足：由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染；在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异；对设备、仪器的控制技术要求较高。,五、灌流式培养（perfusion culture）,1、把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。,它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部
18、分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。,一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。,如：中空纤维生物反应器,灌流式培养用生物反应器主要有两种形式：,中空纤维半透膜可透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年中空纤维生物反应器被广泛用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,中空纤维反应器示意图,细胞,培养基出口,空气与CO2出口,空气与CO2入口,培养基入口,固
19、定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。,另一种形式是固定床或流化床生物反应器,轴向绝热式 径向绝热式 列管式,固定床反应器：气体流经固定不动的催化剂床层进行催化反应的装置,流化床反应器：固体颗粒被流体吹起呈悬浮状态，可作上下左右剧烈运动和翻动，好象是液体沸腾一样，故流化床反应器又称沸腾床反应器。,1旋风分离器2筒体扩大段
20、3催化剂入口4筒体5冷却介质出口6换热器7冷却介质进口8气体分布板9催化剂出口10反应气入口,2、灌流式培养的优点：细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107-109/ml，从而较大的提高了产品的产量；连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。,六、细胞工厂培养,聚苯乙烯材料，无菌，长度335mm，宽度205mm,这套系统使用很方便，可产生类似塑料培养瓶的效果。由组织培养级聚苯乙烯制成，使用后可随意处
21、理。其最大缺点是：经胰酶消化后，很难将细胞完全洗出。,第四节 动物细胞大规模培养用生物反应器简介,动物细胞培养技术能否大规模工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器。首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成。,细胞培养罐,一、生物反应器分类,1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器；,2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器；,3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器。,按其培养细胞的方式不同，可分三类：,二、
22、搅拌罐生长反应器,最经典、最早被采用。针对动物细胞培养的特点，采用了不同的搅拌器及通气方式。通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，使养分充分被细胞利用，并增大气液接触面，有利于氧的传递。,三、气升式生物反应器,1979年首次成功应用气升式生物反应器进行了动物细胞的悬浮培养。气升式生物反应器的优点：罐内液体流动温和均匀，产生剪切力小，对细胞损伤较小；可直接喷射空气供氧，因而氧传递率较高；液体循环量大，细胞和养分都能均匀分布于培养液中；结构简单，利于密封并降低了造价。,四、鼓泡式生物反应器,与气升式反应器相类似，是利用气体鼓泡来进行供氧及混合，其设计原理与气升式生物反应器也相同。,五、中
23、空纤维生物反应器,用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。,优点：占地空间少；细胞产量高，细胞密度可达109数量级；生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。,板框式中空纤维反应器,液营养 中空纤维板,注意几个问题：,(一)细胞培养环境(1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：高乳酸浓度必将抑制细胞生长(3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。(4)甲基乙二醛(Mc)：对细胞有潜在的损伤作用(5)渗透压：恒定、适宜(6)载体：可考虑采用多孔径载体替代容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。,
24、(二)细胞死亡与凋亡,大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。用基因工程方法将bcl2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，bcl2基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止”过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。,(三)培养基与细胞系,动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质量、成分等对细胞造成的
25、污染、毒性和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。,(四)过程监控,测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等均得以应用。,测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。用亲
26、和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性。,计数法(细胞运输),当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法。具体方法：选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。一般经45天运输对细胞活力无大影响。时间过长,细胞活力下降。到达后，倒出大部分培养液
27、，保留维持细胞生长所需的液体量。置37摄氏度培养，次日传代。,十一 动物细胞体外培养举例,肿瘤细胞的体外培养与建系过程 体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了动物细胞体外培养的发展历史。1952年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上第一个细胞系子宫颈癌细胞的细胞系，并且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。,肿瘤细胞培养的发展成就主要体现在以下几个方面：,(1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血细胞源性的发展历程。(2)在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系的建立的发展过程。(3)培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再
28、到无血清培养基三个阶段。(4)生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水平，再到酶和分子水平的发展。,原代培养物经首次传代后，能在体外继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而，这并不意味着细胞能永久生长。可能过了若干代后，由于微生物污染、细胞分化成熟、细胞不适应外界环境等因素影响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能力，可分为有限细胞系与无限细胞系两类。一般认为，如果细胞能在体外培养超过50代，培养时间超过一年，而且细胞的倍增时间保持稳定时，就可以认为建系成功。,人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系为例建系过程：,(1)取材(2)原代培养(3)建系过程 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长。2
29、周后，可见成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快.细胞在传代三次后 贴壁生长的细胞呈现上皮状。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长,命名为CNE-2。经生物学特性分析后确定细胞系建立成功.,六、生物反应器的设计和放大设计的总体考虑,结构严密，能耐受蒸汽灭菌，采用对生物催化剂无害和耐蚀材料制作，内壁光滑无死角，内部附件尽量减少，以维持纯种培养需要；有良好的气-液接触和液-固混和性能和热量交换性能，使质量与热量传递有效地进行；保证产物质量和产量前提下，尽量节省能源消耗；减少泡沫产生，或附有消沫装置以提高装料系数，并有必要可靠的参数检测和控制仪表并能与计算机联机。,一种新的生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，会遇到生物反应器的逐级放大问题，每一级约放大10100倍。生物反应器的放大，表面看来仅是一个体积或尺度放大问题，实际上并不是那么简单。,半理论半经验,氧传递问题,传热,
