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1、1,Merry,Christmas!,第六章 外源基因的表达,2,五、酵母表达系统,酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。,3,酵母菌的特点：,基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。,4,1、酵母基因表达载体,酵母克隆和表达载体是由：酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）
2、、宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。,5,DNA复制起始区,酵母表达载体包含两类复制起始序列：,在大肠杆菌中复制的复制起始序列,在酵母菌中引导进行自主复制的序列,6,选择标记,营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。,显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。,G418：氨基糖苷类抗生素Cycloheximide：蛋白合成抑制剂,7,有丝分裂稳定区,酵母菌表达载体在细胞内拷贝数少，分子质量较大，相当于微型染色体。表达载体上的有丝分裂稳
3、定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。,8,表达盒,表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为1730个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。,9,2、酵母基因表达载体的种类,（1）自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid，YRP）,该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。优点：在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可
4、达200个。缺点：经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。,10,（2）整合型质粒载体（yeast integration plasmid，YIP）,整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换（插入）整合和双交换（或替换）整合两种方式。,11,（3）着丝粒型质粒载体（yeast centromeric plasmid，YCP）,该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到
5、子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有12个拷贝。,12,该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝。在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因赭石突变抑制基因 SUP4表达时菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。YAC载体可插入200800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。,（4）酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,13,3、酵母基因表达系统宿主菌,主要包括,酿酒酵母*,巴斯德毕赤酵
6、母,乳酸克努维酵母,多型汉森酵母,14,4、在酵母中高效表达外源基因的策略,选择合适的受体细胞系统提高表达载体在细胞中的拷贝数提高外源基因的转录水平,15,六、哺乳动物细胞基因表达系统,哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等过程。,16,1、哺乳动物基因表达载体的组成特征,哺乳动物基因表达载体,质粒载体,病毒载体,哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。
7、,17,哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：,基因的转录元件：即转录的启动子、增强子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；,用于筛选转化子的选择标记；,在细菌中进行复制和筛选的元件；,基因表达的调控元件。,18,（1）复制子,表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体能以附加体的形式进行复制。通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。,19,（2）启动子和增强子,表达载体的启动子长为100200bp，位于转录起始位点上游。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒。病毒载体
8、的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。,20,（3）终止信号和加poly(A)信号,RNA聚合酶的转录终止和加poly(A)信号依赖于DNA模板上两种特异的序列，一是位于poly(A)位点上游1130个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA，二是poly(A)位点下游的GU丰富区或U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。,21,常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。,22,（4）剪接信号,
9、外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信号后，内含子被剪除并形成成熟的mRNA。mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 和3 边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。若外源基因为cDNA，表达载体中不含内含子剪接信号，也不会影响其表达。,23,（5）选择标记基因,为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：,24,25,2、哺乳动物基因表达载体,不带真核复制起始序列的质粒型载体（整合）带真核病毒调控序列元
10、件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体牛乳头瘤病毒（BPV）衍生载体人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体反转录病毒（retrovirus）衍生的表达载体,26,3、哺乳动物基因表达宿主细胞,哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。,在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。,27,CHO-K1细胞,CHO-K1细胞中国仓鼠卵巢的上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏
11、二氢叶酸还原酶（dhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml以上。,二氢叶酸还原酶可降解氨甲蝶呤,氨甲蝶呤可抑制DNA和RNA的合成。,28,外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。,该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素、干扰素、凝血因子等在CHO细胞中得到表达。,CHO-K1细胞特点,29,COS细胞,它来源于非洲绿猴肾细胞系
12、（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。,COS细胞的特点：,细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。,30,由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。,31,鼠骨髓瘤细胞,鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。,鼠骨髓瘤细胞的特点：,细胞易于培养和转染，可在无血清培养
13、基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。,32,4、提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略,（1）设法提高外源基因的表达水平和产量（2）改造宿主细胞的特性（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期（4）提高表达蛋白糖基化水平,33,七、植物细胞基因表达系统（自学）,34,第四节 基因表达产物的检测与分离纯化p389,一、基因表达产物的检测,外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。,检测特异性mRNA的方法,Northern杂交法,检测特异性蛋白质的方法,生化反应检测法,免疫学检测法,生物学活性检测法,35,1、外源基因转录产物的检测,South
14、ern杂交可以检测到外源基因是否存在于受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。而利用Northern杂交技术可以检测外源基因是否转录出mRNA。,检测外源基因转录产物还可采用RT-PCR的方法。,36,2、报告基因的酶法检测,报告基因必须具备两大特点：,其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不存在；其表达产物便于检测。,37,报告基因一般是编码酶的基因,哺乳动物细胞基因工程中：氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）、-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）等。植物基因工程中：GUS基因、CAT基因、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、荧光
15、素酶基因和抗卡那霉素基因（npt-基因）等。,38,cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活性，因而cat基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。cat的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。,cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测
16、,39,gus（-葡萄糖苷酸酶）基因的检测,gus基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酸酶，该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性，许多细菌及真菌也缺乏内源gus活性，因而gus基因被广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用得最多。,40,荧光素酶基因的检测,用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌或萤火虫。萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在Mg2+、ATP及O2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成光能。,荧
17、光素ATP+O2 氧化荧光素CO2+AMP+PPi+光,萤火虫荧光素酶,细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。,RCHO+O2+FMNH2 RCOOH+H2O+FMN+光,细菌荧光素酶,检测方法有两种：,活体内荧光素酶活性检测,体外荧光素酶活性检测,41,dhfr（二氢叶酸还原酶）基因的检测,dhfr基因又称氨甲蝶呤抗性基因，编码二氢叶酸还原酶。该酶能催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，而四氢叶酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤与二氢叶酸结构类似，能竞争性抑制二氢叶酸还原酶的活性。植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤极为敏感，而来自
18、于细菌或小鼠的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤的敏感性很低。用细菌的二氢叶酸还原酶作为报告基因，可使转基因植物细胞在一定浓度的氨甲蝶呤培养基中正常生长，而非转化的植物细胞则不能生长。,42,3、免疫学检测,免疫学检测,免疫沉淀法*,酶联免疫吸附法,Western沉淀法*,固相放射免疫法,（抗原-抗体）,43,免疫沉淀法,可应用于表达产物的定性与定量分析。优点：选择性好，灵敏度高，可检测出100pg水平的放射性标记蛋白，并可从蛋白质混合物中提纯出抗原抗体复合物。,44,免疫沉淀法的步骤：,对靶细胞进行放射性标记。细胞裂解。形成特异性免疫复合物。靶蛋白的免疫沉淀。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。,45,酶
19、联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）,ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液液抗原抗体反应体系不同之处是建立了固液抗原抗体反应体系，并采用酶标记。抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出1pg的目的物。同时酶反应还具有很强的特异性。因此ELISA是基因表达研究中不可缺少的方法。除了可溶性抗原（抗体）之外，ELISA还可以检测含表面抗原的细胞。,46,ELISA检测外源基因表达蛋白的四个步骤：,抗体制备（普通抗体、酶标记抗体一抗、二抗）抗体或抗原的包
20、被(固定在固相载体上）免疫反应特异性表达产物的检测,47,48,49,示意图,ELISA用血清来检测,50,Western印迹法,Western杂交是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定融为一体的蛋白质检测方法。它具有很高的灵敏性，可从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白质。若是提纯的蛋白质，可检至15ng。,51,原理：,转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。从细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位印迹到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然
21、后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。,52,Western印迹法的五个步骤：,转基因植株蛋白质的提取SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质蛋白质条带印迹探针制备杂交,53,4、表达产物生物学活性检测,当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时，可根据酶的催化反应来确定外源基因表达与否和表达的程度。该方法简便且易于操作，在反应体系中加入特定的底物和基因表达产物的抽提物就可根据反应现象进行定性和定量的分析。,54,二、基因表达产物的分离纯化,基因表达产物分离纯化的步骤：,细胞破碎,离心分离,柱层析,电泳,5
22、5,1、细胞的破碎,对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。,常见的细胞破碎方式,变性剂裂解法（SDS、NP40）,超声波破碎法,机械破碎法,酶裂解法（降解）,56,2、离心,离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等；,高速离心：,超速离心：,离心力一般100,000g以上，可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。,附：离心力和转速的换算公式：,RCF=11.18(N/1000)2r,RCF：相对离心力，单位为重力加速度gN：转头旋转速度（转速），用r/min表示r：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离
23、，单位为厘米（cm）,57,3、特异性表达蛋白的初步分离,沉淀法：,超滤浓缩法：,根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分离的一种方法（滤膜过滤）。,简便有效，能处理大量的样品、并除去大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂对离心后的样品进行分步沉淀。该法也常用于蛋白质的浓缩。,58,4、柱层析,包括凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、金属螯合层析、共价层析、疏水层析、亲和层析等。,59,层析的基本原理：所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在
24、两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。,柱层析纯化蛋白质的步骤：,装柱,柱平衡,上样,洗脱,分部收集,检测,阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换,离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。,61,5、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,适用于分离低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及DNA序列分析。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。通常是丙烯酰胺单体在过硫酸氨（AP）的引发和N,N
25、,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）的增速下，产生聚合反应，形成长链。又在N,N-甲叉双丙烯酰胺的作用下，聚丙烯酰胺长链发生交叉连接而形成凝胶。聚合链的长度和交叉连接的程度决定了凝胶网孔的大小。,62,由于空气中的氧能够抑制丙烯酰胺单体的聚合，所以凝胶的制备是向封闭的双玻璃板夹层中灌胶完成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳通常采用垂直的方式。,63,缺点：和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的整个过程显得有些繁琐。,优点：分辨率极高，可分开长度仅相差0.1的DNA分子，即1000bp中相差1bp；其装载量远大于琼脂糖凝胶，多达10g的DNA可加样于聚丙烯酰胺凝胶中的一个标准加样孔（1cm1cm），而其分辨率不会受到显著影响。从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用于要求最高的实验，如鼠胚显微注射。,64,PAGE,Native-PAGE：主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化。,SDS-PAGE：主要用于变性的表达蛋白的分离与纯化。在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳泳动率主要取决于蛋白质分子质量的大小，而蛋白质分子的荷电状态可以不考虑。,65,
