第三章生物细胞培养基灭菌设备课件.ppt

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1、发酵机械与设备,徐 明 芳 博 士教 授暨 南 大 学 生 科 院2015-09-25,目录,绪论第一篇 生物质原料处理设备第二篇 生物反应设备第三篇 产物分离设备第四篇 其他设备,第一篇 生物质原料处理设备,第一章 生物质原料预处理设备第二章 生物细胞培养基制备设备第三章 生物培养基灭菌设备,本章内容,第一节培养基湿热灭菌的原理第二节常用的灭菌设备第三节常用的连续灭菌流程第四节发酵罐实罐灭菌操作要点,底物,生物反应器,检测控制仪表,培养基,（培养基灭菌）,经加工原料,酶,细胞,生物催化剂（游离或固定化）,机械能,除菌,空气,产品提取纯化,副产品产品废物,热能,原材料,营养物,典型工业生物技术

2、过程,核心技术？,培养基制备工艺过程：,原 料 筛 选 粉 碎 糊 化（蒸煮、酶）糖 化（酶法）灭 菌 冷 却,思考题,1.工业上防止杂菌污染的措施有哪些？2.如何计算灭菌时间？3.某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。4、板式换热器的结构域工作原理5、喷淋冷却连续灭菌主要设备与灭菌流程6、喷射加热连续灭菌主要设备与灭菌流程7、薄板式换热器连续灭菌主要设备与灭菌流程8、某发酵罐内装培养基50m3,在121下进行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，求

3、理论灭菌时间？（分批灭菌的灭菌常数 lgk=-14889/T+38.127）9、发酵罐实罐灭菌操作要点？10、发酵罐的灭菌操作步骤,第一节培养基湿热灭菌的原理,1、概述：染菌的危害2、生物工程工业上防止杂菌污染的措施3、实验室灭菌的常规设备4、湿热灭菌原理与计算,1、概述染菌的危害：,现代生物技术工业涉及的生物培养往往是纯种培养，需对培养基等进行灭菌。生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可

4、使生产菌发生溶菌现象。,灭菌的定义,定义：是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌主要是杀灭杂菌。灭菌与消毒的区别：灭菌 是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有 微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,2、生物工程工业上防止杂菌污染的措施,1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，生物反应器维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。,培养基灭菌的目的和要求,目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的

5、条件。要求：达到要求的无菌程度(杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度,10-3个/罐）；尽量减少营养成分的破坏。,在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,3、实验室灭菌的常规设备,化学法化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等物理法干热灭菌法湿热灭菌法（生物工程工业常用方法）射线灭菌法,实验室灭菌器,实验室灭菌器,实验室灭菌器,4.湿热灭菌原理和影响灭菌的因素,湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。致死温度与致死时间

6、：杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。,蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。,湿热灭菌的优点,微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N-任一时刻的活细菌浓度，个/L；t-时间，min；K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热,微生物的热力致死动力学方程：对数残留定律,取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得 或 为理论灭菌时间的对数残留规律公式。,问题：能不能做到绝对无菌？,湿热灭菌时间的计算,将培养基中的

7、杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热灭死动力学反应器的形式和操作方式培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式(N/N0)=-kt 来粗略估算灭菌所需时间。,灭菌时间的估算,细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,灭菌时间的估算,例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下

8、实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。解：N0=401062105=81012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)(Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015)=20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。,第二节常用的灭菌设备,1、板式换热器灭菌2、管道式换热器灭菌,一、板式换热器灭菌,采用薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培

9、养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。,板式换热器,一、板式换热器的应用与结构,2009.09,郑裕国 王远山 汪钊 陈小龙 朱勍 徐建妙,压板,中间接管,支架,换热片,密封圈,冷热流体进出管,1、板式换热器的组成,板式换热器流程组合,板式换热器的特点,1、传热效率高，K 2、结构紧凑，占地面积小，但传热面积大3、适应性强，当需改变工艺条件即生产能力时，只需增建板片数即可4、适宜处理热敏性物料5、便于清洗，拆卸方便6、卫生安全。7、热利用率高，可同时进

10、行加热与冷却。8、连续生产，劳动强度低9、密封圈宜脱落、产生泄漏。,管 式 换 热 器,二、新型列管事换热器灭菌,管 式 换 热 器,管 式 换 热 器,管式超高温灭菌外形,第三节常用的连续灭菌机与流程,即在培养基输送至发酵罐的同时进行加热、保温和冷却而进行的灭菌。,三类连续灭菌（连消）,工艺流程1.喷淋冷却连续灭菌流程2.喷射加热连续灭菌流程 3.薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算(Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct)式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。,例2某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含

11、有2105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。,1、连续灭菌时间的估算,解：C0=2105(个/ml)Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min,加热,保温,冷却,2、连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程,（1）连消塔,在2030s或更短的时间内将料液加热至130140。生产中一般用0.50.8Mpa的活蒸汽与预热后的料液直接接触而加热。套管式连消塔用:内外两根管子套合组成内管开有45向下倾斜的小孔，孔径6mm。孔距应从上到下减少，使

12、蒸汽较为均匀。培养基由塔底进入，与小孔中喷出的蒸汽连续混合后在塔上部流出。培养基在塔内停留时间一般取2030s；线速度要求0.1m/s。,设备构造（1）连消塔 是培养液高温短时间连续灭菌设备，它与维持罐组成连续灭菌系统，分套管式和汽液混合式两类。,（2）维持罐,灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，也称保温设备。体积计算：V-维持罐容积，m3；v-料液体积流量，m3/h；-维持时间，825min；充满系数,（3）冷却设备,常用喷淋冷却器和套管冷却器。喷淋冷却器是将冷却水通过喷淋装置均匀的淋在水平的排管上，以冷却管内的培养基。套管冷却器是一种内管

13、走热培养基，内外管间的管隙中走冷却水的冷却器。耗钢多，漏洞难以发现，会造成污染 热利用较合理,（4）连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程,加热,保温,冷却,连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程,（1）配料预热罐，将配好的料液预热到6070，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126132）；（3）维持罐，维持料液温度，延长灭菌时间（4）冷却管，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到4050后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,2、喷射加热-真空冷却流程,（1）喷射加热器 可使料液和蒸汽迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内

14、完成的。,蒸汽,优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏最少，可以采用高温灭菌，把温度升高到140而不致引起培养基营养成分的严重破坏。设计得合适的管道维持器能保证物料先进先出，避免过热。缺点：受压力影响，出料泵,（2）、喷射加热-真空冷却流程,（1）喷射加热器以较高速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合，可以采用高温灭菌，把温度升高到140而不致引起培养基营养成分的严重破坏。（2）管道维持器：维持灭菌时间（3）真空闪急蒸发室：由膨胀阀进入，因真空作用使水分急骤蒸发而冷却到7080左右，再进入发酵罐冷却到接种温度。,4、板式换热器灭菌流程,采用薄板换热器作为培养液的加热和冷却器培养液在设

15、备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。,压板,中间接管,支架,换热片,密封圈,冷热流体进出管,（1）、板式换热器,压板,中间接管,支架,换热片,密封圈,冷热流体进出管,1、板式换热器的组成,优点：灭菌的温度较高，灭菌时间较短，培养基的营养成分受破坏的程度较低，从而保证了培养基的质量；设备的利用率高；缺点：过程所需的设备较多，操作较为麻烦，染菌机会也相应较多,5.连续灭菌流程特点,连续灭菌优点：（1）提高产量；（2）产品质量较易控制；（3）蒸汽负荷均衡，锅炉利用

16、率高，操作方便；（4）适宜采用自动控制；（5）降低劳动强度。实际操作：高温灭菌时间约为1530s，然后根据发酵类型不同在维持罐维持825min。,在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程,第四节发酵罐实罐灭菌操作要点,升温阶段将培养基从室温加热到灭菌温度,两种方式:用蛇管或夹套用蒸汽间接加热(到90),再直接通入培养基至灭菌温度直接通入活蒸汽10立方发酵罐(7吨培养基)升温需1.6吨蒸汽,保温需0.5-0.8吨蒸汽,1、孢子热死亡的规律符合,升温,保温,冷却,因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：Kh-保温阶段的孢子比热死亡速度常数,温度随灭

17、菌时间的变化,培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过 程，通常也称为实罐灭菌。间歇灭菌过程包括升温、保温和冷却等三个阶段，图57为培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况。,2、分批灭菌的灭菌常数,通常以耐热芽孢杆菌为对象，其热死灭活化能为67930 K/mol,A=1.341036 1/秒,R=1.987K/mol,e=2.718,为灭菌温度的单一函数，计算如下式:lgk=-14845/T+36.127,3、计算举例-理论灭菌时间,某发酵罐内装培养基40m3,在121下进行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，求理论灭

18、菌时间？（分批灭菌的灭菌常数 lgk=-14845/T+36.127）,解：N0=40106107=41014 N=0.001 lgk=-14845/T+36.127=-14845/(273+121)+36.127=-1.55 k=0.0281 s-1 t=1/k lnN0/N=1/0.0281 ln41014/0.001=1442.6 s=24 min,4、分批灭菌-实罐灭菌操作要点,设备严密度温度与气压是否对应。培养基及发酵设备的灭菌包括分批灭菌（也称实罐灭菌或实消）、空罐灭菌（空消）、过滤器及管道灭菌等。,分空气过滤器灭菌并用空气吹干,夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹

19、套内通蒸汽,达70左右,取样管,放料管,通蒸汽,120，1105pa,保温,保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定,罐压接近空气压力,向罐内通无菌空气,保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门,夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度,分批灭菌（实罐灭菌）1.灭菌工艺过程,灭菌流程（三路进气、四路出气）,与罐相连的分空气过滤器用蒸汽灭菌并用空气吹干。将输料管路内的污水放掉冲净，培养基泵送至发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器进行灭菌。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至8090，将排气阀逐渐关小。,三路进汽：直接

20、蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,*,四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气,分批灭菌设备示意图,总蒸汽管道压力要求不低于0.3-0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。空消：一般维持罐压0.150.2Mpa，罐温125130，保持3045min；,将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中，使罐温上升到118120，罐压维持在0.090.1Mpa（表压），并保持30min左右。各路进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要激烈；各路排汽也要畅通，但排汽量不宜过大，以节约用气量。,三路进气,保温阶段，凡进口在

21、培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进汽；凡开口在液面之上者均应排汽。管路在实消时均应遵循“不进则出”的原则。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温后接种。,间歇灭菌,是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用 开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通人蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70

22、左右时，从取样管和放料管向罐内通人蒸汽进一步加热，当温度升至120C，罐压为1100Pa(表压)时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，并调节好各进汽和排汽阀门的排汽量，使罐压和温度保持在一定水平上进行保温。当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通人蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。,保证间歇灭菌成功的要素内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠

23、，蛇管无穿孔现象压力稳定的蒸汽合理的操作方法。,发酵罐的接管图,培养基间歇灭菌过程中应注意的问题,温度和压力的关系泡沫问题投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题灭菌结束后应立即引入无菌空气保压,分批灭菌的优缺点优点设备投资较少染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点：（适用于大型罐

24、）可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,连续灭菌与间歇灭菌的比较,1），连续灭菌的优缺点优点保留较多的营养质量容易放大较易自动控制；糖受蒸汽的影响较少；缩短灭菌周期；在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。缺点：设备比较复杂，投资较大。,5、发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,工欲善其事，必先利其器 论语魏灵公,再见！,啤酒生产流程,啤酒酿造流程,