《噬菌体抗体淘筛方法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《噬菌体抗体淘筛方法.doc（8页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、这两个文库来自于单个人的VH和Vk的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a,
2、 H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2.确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。3.参照方案G制备KM134.在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 mg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 mg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄
3、糖的2倍TY培养基内， 37过夜培养。分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 mg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5.尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。6.为提高感染效率，大肠杆菌应该在37培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37震荡过夜培
4、养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。（1.5-2小时）7.所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4下进行。8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。In advance准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理）在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作StepsProcedureDay 1 (5 hrs)A1-A6Grow libraries I and J and make phageB1-B3
5、Make secondary stock of libraries第一天 A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体 B1和B3 制作文库的第二原种Day 2 (6 hrs)A7-A12Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1Coat immunotubes for 1st round of selection第二天 A7-A12 增殖文库I和J，并且制备噬菌体 C1 包被第一轮筛选用免疫管Day 3 (6.5 hrs)C2-C111st round of selection第三天 C2-C11 第一轮筛选Day 4 (3 hrs)D1-D
6、6Make phage from 1st round of selectionC1Coat immunotubes for 2nd round of selection第四天 D1-D6 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体 C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 5 (6.5 hrs)D7-D11Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C112nd round of selection第五天 D7-D11 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体（继续） C2-C11 第二轮筛选Day 6 (3 hrs)D1-D6Make phage from 2nd
7、round of selectionC1Coat immunotubes for 3nd round of selection第六天 D1-D6 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续） C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 7 (6.5 hrs)D7-D11Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C113rd round of selection第七天 D7-D11 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续） C2-C11 第三轮筛选Day 8 (3 hrs)D1-D6Make phage from 3rd round of selectio
8、nE1Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISA第八天 D1-D6 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体 E1 包被多克隆噬菌体ELISA用的96孔板Day 9 (6.5 hrs)D7-D11Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8Polyclonal phage ELISA第九天 D7-D11 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体（继续） E2-E8 多克隆噬菌体ELISA每个克隆的进一步的描述可以通过单克隆噬菌体ELISA（方案E），单克隆噬菌体ELISA用水溶性的scFv 片段（方案F）。P
9、CR检测（检测插入，方案H）和测序（方案I）1.将文库的加入到200ml预热的含有100 mg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基上2.37C振荡培养至OD 600为0.43.从中取50ml，加入2x1011 KM13辅助噬菌体（剩余的150ml在方案B中用来制备文库的第二细菌储存液）4.37C水中温浴30分钟5.3000g,离心10min,用100ml含有100 mg/ml氨苄青霉素、50 mg/ml的卡那霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基6.30度振荡过夜培养7.将过夜产物在3300g离心30分钟8.取上层液体80ml，加入20mlPEG/NACL(含20 % PEG，2.5 M
10、 NaCl)溶液9.3300g离心30分钟，倒掉PEG/NACL溶液，重新离心，吸去剩余的PEG/NACL溶液10用4mlPBS缓冲液悬浮沉淀，11600g离心10分钟，去掉任何剩余的细菌残渣11.短期使用的话可以保存在4，长期保存的话置于含有15%甘油的PBS中，-70保存。12.将噬菌体稀释100倍，然后继续稀释至6个浓度，加入900ml OD 600 为0.4的TG1至每一个管中，37C水浴30min,取每个稀释浓度的10ml加入到TYE培养基上，其中包含100 mg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖，37摄氏度过夜培养。浓度在1012-1013/ml，至少可以进行10次筛选1将A3步骤中剩
11、余的150ml液体，37摄氏度下振荡培养2小时2、10800g离心10分钟，用10ml含有15%甘油的2xTY 悬浮3、每管500微升，分装20管，保存于-70。每次制备的时候用其中一管。这个仅限于你打算做超过10次筛选的时候。或者，噬菌体可以用生物素酰化的抗原或者亲和层析来完成1、用目的抗原4ml过夜来包被免疫管。包被的效率取决于抗原的浓度，温度和缓冲液，通常用抗原浓度10-100 mg/ml的PBS缓冲液。2.第二天用PBS缓冲液洗三次（倒入管内，然后马上倒出来）3.用含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液注满管子，室温下孵化，置于工作台上两个小时候停止4.用PBS缓冲液洗管3次5.将1012-
12、1013噬菌体键入到 4ml的含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液。室温下旋转培养孵育60分钟，然后静止培养60分钟，弃掉上清液6.用含有0.1%的吐温20的磷酸缓冲液洗管子10-20遍7.甩干多余的PBS缓冲液，用含有50 ml of 10mg/ml胰蛋白酶的磷酸缓冲液500微升稀释噬菌体，用可翻滚的摇床室温培养10min.8.取1.5mlOD值为0.4的大肠杆菌TG1，加入250 ml稀释后的噬菌体（剩余的4C保存），37水浴30min.9.吸取液体，及稀释100倍的，和稀释10000倍的溶液各10微升，加到含有100 mg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上，37度过夜培养来测定噬
13、菌体10、第一轮筛选时如果用复合抗原，取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 mg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。如果用的是单个的半抗原，糖类或者蛋白质抗原及所有抗原的下面的步骤：取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 mg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。11.37C过夜培养第一轮的筛选是最重要的。任何的错误都会导致以后的错误。每轮结束后最少能够得到100个火星的噬菌体
14、，如果少于这个数量，说明可能出现了错误。所以，试着用新鲜的TG1感染剩余的250ml噬菌体，如果这一步仍然少于100噬菌体，从C1开始重复筛选。1.过夜增殖以后，加7ml含有15%甘油的2 xTY到large square Bio-Assay dish或者加2ml到常规的培养皿，然后用玻璃涂布器松散细胞，彻底混匀。将得到的50 ml细菌接种到50 ml包含100 mg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的2xTY中。剩余的1ml保存在15%的甘油中， -70C保存。2.振荡培养至OD600为0.43.取10ml培养物，加入5x1010辅助噬菌体437C水浴30min5.3000g离心10分钟。用含
15、有50 ml包含100 mg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY悬浮6.30C振荡培养过夜7.将过夜产物3300g离心10分钟8.加入10ml PEG/NaCl (20 % PEG 6000, 2.5 M NaCl)至40ml上清液。混合均匀后置于冰上1小时9.3300g离心30min，倒掉PEG/NaCl液体，重新离心并吸掉剩余的PEG/NaCl液体10.用2mlPBS缓冲液悬浮产物，11600g离心10分钟，去掉剩余的细菌残渣。11.用1ml做下一轮筛选用，剩余的保存在4摄氏度再重复两次筛选每一轮筛选中噬菌体产生的产物可用通过ELISA来鉴定多克隆噬菌体抗体。打个克隆产生的噬菌体
16、可以通过ELISA来鉴定单克隆噬菌体抗体，经过一个多克隆噬菌体Elisa，可以得到单克隆抗体的片段（见方案F）。总的来说，含有2%的脱脂奶粉的PBS缓冲液可以中噬菌体ELISA，而含有3%的BSA的PBA缓冲液可以中断scFv ELISA.1.用筛选时用过的缓冲液，每个孔100微升抗原来包被96孔板，4，过夜。2.用磷酸缓冲液洗孔3次，板子可以浸入到浅的缓冲液中，但是一定要确保每个孔都充满（否则容易产生假阳性）。轻弹板子弃掉液体，然后摇晃。每孔加入含有2%的脱脂奶粉的PBS缓冲液或者含有3%的BSA的PBS缓冲液，室温下孵育2小时。3.用磷酸缓冲液洗孔3次，加入10微升每轮筛选后PEG沉淀下来
17、的噬菌体，100微升的2%的脱脂奶粉的PBS缓冲液或者含有3%的BSA的PBS缓冲液。4.室温孵育一个小时。去掉溶液，用含有0.1%的吐温20的PBS缓冲液洗三遍。5.加入1：5000的HRP-anti-M13，在含有2%的脱脂奶粉的PBS缓冲液或者含有3%的BSA的PBS缓冲液，室温孵育一个小时，用用含有0.1%的吐温20的PBS缓冲液洗三遍。6.加入100微升的底物溶液（100mM的醋酸钠溶液中溶解的100 mg/ml TMB，提前按照每50ml加入10微升30%的过氧化氢），7.加入50微升l 1 MH2SO4的终止反应，蓝色应该变黄。测定650和450nm的OD值。OD450减去OD6
18、50.9.将每轮筛选后的滴定的培养皿上的克隆接种到100微升含有100 mg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY悬浮，置于96孔培养板。250RPM，37摄氏度过夜振荡培养。10.用移液器吸取2微升转移到另外一个每孔含有200微升含有100 mg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY的培养板内，250RPM，37摄氏度振荡培养2小时。（加入甘油至终浓度为15%，-70保存平板）11.2小时孵育后，加入25微升100 mg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的2xTY，以及109辅助噬菌体12.250RPM，37摄氏度振荡培养1小时，1800g离心10分钟，吸掉上清13.用200微
19、升含有100 mg/ml氨苄青霉素 and 50 mg/ml卡那霉素的2xTY悬浮沉淀。250RPM，30摄氏度过夜振荡培养.14、1800g离心10分钟，取50微升上清，前面详述的噬菌体ELISA每轮筛选得到的每个克隆都可以诱导到TG1中产生可溶性的scFv (F2-F6)。这样确保每个筛选得到的克隆的表达产物包含TAG终止密码子（TG1会抑制末端并且在这些位置产生一个谷氨酸残基），然而，scFv 和the gIII gene 之间的TAG密码子也会被抑制，这就导致了scFv-pIII融合的共表达，降低了scFv的总体表达水平，即使那些克隆中本身并没有TAG终止密码子。为了解决这个问题，选择
20、好的噬菌体可以用来感染HB2151（一个没有抑制基因的菌株），可以介导抗体的片段的表达。（不含有TAG密码子的scFv基因可以得到比TG1更多的片段，而包含TAG密码子的将得不到任何片段）。表达的片段可以用来做ELISA。可以用Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16的共和物来实施结合scFv的检测。1.从每轮筛选中取出10微升稀释后的噬菌体，感染200微升指数生长期OD600为 0.4的HB2151，37C水浴30分钟。划板，50微升，50微升1：100的稀释液，50微升1：10000，50微升1：1000000，培养基为含有100 mg/ml 氨苄青霉素and
21、1 % 葡萄糖的TYE培养基。37过夜培养。2.挑单克隆加入到含有100 mg/ml 氨苄青霉素and 1 % 葡萄糖的100 ml 2xTY培养基中，置于96孔培养板，过夜培养。3.用96孔用的移液器吸取2微升，置于两外一个包含100 mg/ml 氨苄青霉素and 0.1 % 葡萄糖的200 ml 2xTY培养基的96孔板中，250RPM，37摄氏度培养至OD600 为0.9（约3小时）（可以从第一个版中取样保存，加入甘油至终浓度为15%，保存于-70）4.OD600到0.9之后，马上加入25微升包含100 mg/ml氨苄青霉素和9 mM IPTG（中浓度时1 mM IPTG)）5.用筛选时
22、用到的一样的缓冲液来包被抗原，每孔100微升，过夜。步骤F4得到的产物1800g，离心10分钟，用50微升上清液用来做ELISA，在3% BSA-PBS中，出去用1:5000 的 Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 t来检测结合抗体之外。1.用OD600为0.4的TG1菌株200微升感染KM13辅助噬菌体的100倍的稀释液体10微升（为了更好的得到分离的噬斑），37水浴30分钟。加到3ml融化好的琼脂，倒入热的的TYE平板中（不含抗生素）。37过夜2.挑一个小的噬菌斑，加入到5ml新鲜的OD600在0.4的TG1中，37振荡培养2小时。3.加到装有500ml2
23、xTYde 2L的烧瓶中，37振荡培养1小时，加入卡那霉素至终浓度为50 mg/ml，不加葡萄糖。30振荡培养过夜。4.将过夜产物10800g离心15min,加入100ml PEG/NaCl (20 % PEG 6000, 2.5 M NaCl)至400ml上清液中，置于冰上1小时。5.10800g离心30min,倒掉PEG/NaCl6.加入8mlPBS和2ml PEG/NaCl，混合均匀置于冰上20min.7.3300g离心30min,快速离心，吸取掉任何剩余的PEG/NaCl8.用5mlPBS悬浮沉淀，11600g离心10min，去掉剩余的细菌残渣9.辅助噬菌体短期储存的话可以放在4摄氏度
24、，长期的话需要添加15%的甘油置于取45微升噬菌体加入5微升胰蛋白酶，37度保温30分钟。取1微升胰蛋白酶处理过的噬菌体加入1mlPBS缓冲液中，以100为单位再连续稀释5个浓度。取留个浓度的各50微升，加入到装有1mlOD600为0.4的TG1的管中，混合均匀，加入3ml融化的琼脂，然后加到TYE平板上。用1微升为经过胰蛋白酶处理的噬菌体做同样的稀释。处理过的噬菌体滴定度应该比未处理过的低105-108。否则应该重新挑一个菌落重复进行。一旦文库筛选之后，需要确认每个克隆的序列，所有的PCR退火温度是55，VH or Vk单独延伸时都是1分钟，如果同时的话延伸的是2分钟。For VH only
25、 useLMB3:CAG GAA ACA GCT ATG AClink seq new:CGA CCC GCC ACC GCC GCT Gwith insert = 527 bpwithout insert = 227 bpFor Vk only useDPK9 FR1 seq:CAT CTG TAG GAG ACA GAG TCpHEN seq:CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 368 bpwithout insert = no bandFor VH and Vk useLMB3:CAG GAA ACA GCT ATG ACpHEN seq:CTA TG
26、C GGC CCC ATT CAwith insert = 935 bpwithout insert = 329 bpFor sequencing of selected clones the following primers are recommended.For VH use link seq newCGA CCC GCC ACC GCC GCT GFor Vk use pHEN seqCTA TGC GGC CCC ATT CA RBSCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATA ATG AAA
27、 TAC CTA- M K Y L LMB3 SfiI _NcoI_TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG TTT L P T A A A G L L L L A A Q P A M A E V F XhoI linkerGAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT D Y W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G Sal
28、I NotI HIS-tagGGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC G S G G G G S T D I Q M T Q A A A H H H H - link seq new myc-tag CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG ACT H H G A A E Q K L I S E E D L N G A A * T - pHEN seq1
29、.2xTY配制方法：16g蛋白胨，10g酵母浸膏，5g氯化钠，定容至1L2.Bovine ubiquitin (5 mg) is available from Fluka, Chemika-BioChemika, Industriestrasse 25, CH-9470 Buchs, Switzerland, Tel +41 81 755 2511, Fax +41 81 756 5449.3.KM13 is the protease cleavable helper phage described in Kristensen and Winter, Folding and Design 3,
30、 321-328 (1998).KM13是蛋白酶可切的辅助噬菌体4.磷酸缓冲液：5.84 g NaCl, 4.72 g Na2HPO4 and 2.64 g NaH2PO4.2H20, pH 7.2, in 1L.5.TYE：15g细菌琼脂，8g氯化钠，10G蛋白胨，5g酵母浸膏，定容至1升6.Nunc Maxisorp immuno test tubes (Cat. No. 4-44202) are available from Gibco BRL, Life Technologies Ltd., P. O. Box 35, Trident House, Washington Road, P
31、aisley, PA3 4EF, Scotland, U.K, Tel +44 141 814 6100, Fax +44 141 887 1167.7. Marvel指的是脱脂奶粉8.Trypsin (T-8642 Type XIII from Bovine Pancreas - Sigma Chemical Company Ltd., Fancy Rd., Dorset, BH17 7NH, U.K, Tel +44 1202 733114; Fax +44 1202 715460) made up in 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM CaCl2 and stored
32、at -20C 9.Nunc Bio-Assay dish is available from Gibco BRL (see note 6).10.Falcon MicroTest III flexible 96 well flat bottomed assay plates are available from Becton Dickinson Labware, Becton Dickinson and Co., 2 Bridgewater Lane, Lincoln Park, NJ 07035, USA.11.HRP-anti-M13 is available from Pharmaci
33、a (see note 3b).12.TMB is 3,3,5,5-tetramethylbenzidine and is available from Sigma (see Note 8). A 10 mg/ml stock solution can be made by dissolving the TMB in DMSO.13.Corning Cell Wells flat-bottomed multiple well tissue culture treated plates are available from Corning Glass Works, Corning N.Y. 14
34、831. USA.14.The 96 well transfer device is a piece of wood the size of a microtitre plate with a handle on one side and 96 metal pins (each 7 cm long with a concave end) on the other. This can be sterilised between bacterial transfer by immersion in a bath of ethanol and then by flaming (hold well a
35、way from your body and any flamable objects). If you havent got one of these (or something similar) you will have to make one yourself or alternatively use a multichannel pipette for bacterial transfer.15.Horse Radish Peroxidase conjugated Protein A is available from Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK. Tel: +44 01494 544000; Fax: +44 01494 542929.14.Horse Radish Peroxidase conjugated Protein L is available from Actigen Ltd, 5 Signet Court, Swanns Road, Cambridge, CB5 8LA, UK. Tel: +44 01223 319101; Fax: +44 01233 316443.
