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1、骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2的表达及可能机制中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2010Nov;26(11):146361463?骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2的表达及可能机制贾晓明,杨建平,王丽娜,钟丽敏,高建瓴,许期年.,王秀云,左剑玲(苏州大学附属第一医院1.麻醉科,2.脑神经研究室,江苏苏州215006)中国图书分类号:R一332;R322.81;R329.24;R441.1;R738.1文献标识码:A文章编号:10011978(2010)11146304摘要:目的研究骨癌痛大鼠脊髓背角钾离子一氯离子联合转运体2(potassiumchlorideeot
2、ransporter2,KCC2)的表达变化及其可能机制.方法采用大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立胫骨癌痛模型.观测种瘤前后大鼠机械缩足反射阈值(mechanicalwithdrawlthresthold,MWT)和脊髓背角KCC2表达水平的变化,观察痛敏形成前鞘内预注射酪氨酸蛋白激酶B(tyrosineproteinkinaseB,TrkB)中和抗体阻断脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)一TrkB途径对KCC2表达和机械性痛觉超敏的影响.结果大鼠种瘤后612d,MWT明显下降(P<0.01),出现明显的机械性痛敏
3、,脊髓背角KCC2蛋白水平进行性降低(P<0.01);鞘内预注射TrkB中和抗体的骨癌痛大鼠,其脊髓KCC2表达水平和MWT明显高于注射IgG和不作处理的骨癌痛大鼠(P<0.01).结论脊髓背角的KCC2可能参与了骨癌痛的发生发展,而BDNFTrkB途径可能介导了该作用.关键词:胫骨癌痛;KCC2;TrkB;BDNF;脊髓;痛觉超敏KCC2是阳离子一氯离子联合转运体(eantionchloridecotransporters,CCCs)家族中重要一员,主要功能是将氯离子转运出细胞,维持成熟神经元内的低氯状态;这对于抑制性.氨基丁酸(一aminobutyricacid,GABA)能突
4、触传递的超极化效应起着重要作用H.在炎性痛.和神经病理性痛等动物模型中均可以观察到脊髓KCC2表达水平有不同程度的下调;BDNFTrkB途径介导KCC2表达的下调.目前关于KCC2在癌性痛形成过程中表达变化及其可能机制研究尚少.本实验拟通过建立大鼠胫骨癌收稿日期:20100709,修回日期:20100830基金项目:国家自然科学基金资助课题(No30872442,81000479);江苏省卫生厅基金资助课题(NoH200855,H200917)作者简介:贾晓明(1985一),男,硕士生,研究方向:疼痛及其脊髓机制,Email:sdjiaxiaoming126.COil1.CB;杨建平(1957
5、一),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:疼痛及其脊髓机制,通讯作者,Tel:0512-67780149,Fax:0512-65237528,Email:szyangjpsuda.edu.c”痛模型,观察在骨癌痛形成过程中大鼠脊髓KCC2的表达变化,以及鞘内预注射TrkB中和抗体对KCC2表达和机械性痛觉超敏的影响,以探求脊髓KCC2在骨癌痛中的作用及其机制.1材料与方法1.1实验动物体质量180220g的成年早SD大鼠(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,清洁级,使用许可证号:SCXK(沪)20070005),单笼饲养.动物饲养室温为(222),周期光照8:O020:00,大鼠自由进食,
6、饮水.1.2主要试剂和仪器TrkB中和抗体(santacruz,lotF1509);兔IgG(santacruz,lotA2609),兔抗KCC2多克隆抗体(millipore,lotDAM1636103),兔sP试剂盒(SP一9001北京中衫生物公司),机械触诱发痛测量仪(37450UGOBASILE,意大利).1.3实验方法1.3.1蛛网膜下腔置管大鼠用3%水合氯醛(300mg?kg)麻醉后,根据杨建平等改进的方法行脊髓蛛网膜下腔置管.出现肢体跛行,肢瘫,感染或导管脱落者予以剔除.1.3.2癌痛模型的制备参照姚明等的方法制备胫骨癌痛模型.Walker256肿瘤细胞体外培养,调整细胞密度为1
7、10?L.大鼠麻醉后,左胫骨上端切开约5film小口,在胫骨干骺端穿刺打孔,注入10l肿瘤细胞混悬液(110个细胞),医用胶水封口;对照组大鼠注入生理盐水10l.1.3.3实验分组48只大鼠随机为5组,I组(,z=8)为生理盐水对照组,组(n=16)为骨癌痛组,组(n=8)为对照组+TrkB中和抗体,组(n=8)为骨癌痛组+IgG,V组(n=8)为骨癌痛组+TrkB中和抗体.,和V组建模后d4,5,鞘内注射TrkB中和抗体或IgG,每天1次,剂量为210l,每次注射加注10l生理盐水冲洗导管.1.4行为学测试各组大鼠在种瘤前1天及种瘤后16d测定左后肢MWT,此外,I组,组大鼠在种瘤后d9,1
8、2测定MWT.测量时间为每天8:0020:00.大鼠在塑料方格中适应20min,待安静时测定.将测试探针(钝针)对准大鼠后肢足底中间部位,探针对足底匀速加压,当出现快速缩足时,机?1464?中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2010Nov;26(11)器显示此时施加于足底的压力值.分别测3次,每次间隔5min,取平均值为大鼠MWT值,最大值为50g.1.5免疫组织化学染色I组大鼠于d12处死;组大鼠于d6,9各处死4只,d12处死8只;III,V组大鼠于d6处死.腹腔注射3%水合氯醛450mg?kg深麻醉后,经主动脉依次灌注生理盐水200ml,4%多聚甲
9、醛400ml,取脊髓(L4).使用冰冻切片机将脊髓制成30m切片,sP法免疫组织化学染色标记KCC2.组织切片经3%过氧化氢及正常山羊血清孵育后,依次滴加兔抗KCC2多克隆抗体(1:600),4孵育3648h;生物素标记的羊抗兔IgG,37C孵育1h;辣根酶标记链霉卵白素,37C孵育1h;DAB显色,贴片,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,晾干.用PBS代替一抗或二抗作阴性对照.切片用奥林巴斯照相机(Olympus,C7070wz)照相,lmageProPlus6.0软件分析,测定KCC2的平均光密度值(meanopticaldensity,MOD).1.6统计学处理计量资料以s表示,用
10、SPSS13.0统计软件包进行统汁分析,组内比较采用重复测量资料的方差分析,组间比较采用单因素方差分析.2结果2.1接种Walker256细胞引起大鼠MWT的变化与基础值相比,I组大鼠在种瘤后各时间点MWT差异无显着性(P>0.05);组大鼠种瘤后d612,MWT值呈进行性下降,与I组比较,差异有显着性(P<0.01).见labl.2.2骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2表达变化与l组(0.1190.017)相比,组大鼠种瘤后d6(0.0674-0.007),9d(0.0550.003)和l2d(0.0410.006)KCC2平均光密度值(MOD)明显降低(P<0.01).见Figl
11、.A慧黪.:Fig1ExpressionchangeofKCC2inthedorsalhornofspinalcordinbonecancerpainratsDThelevelofspinalKCC2proteinsignificantlydecreasedon,lays6,9and12,fftetinoculation(AI)ini)onecancerpainralscomparedwithshaminjectedcontrolrats.Scalebar:100um.A:GroupI;B:Day6AI(Group);C:Day9AI(GroupII);D:Day12AI(Group)2.3鞘
12、内预注射TrkB中和抗体对骨癌痛大鼠MWT的影响各组大鼠基础MWT值比较无差异(P>0.05).种瘤后d6,与I组比较,组,组和V组大鼠的MwT明显下降(P<0.01),m组大鼠的MWT无变化(P>0.05);与组,组比较,V组MWT明显增高(P<0.01).见Tab2.2.4鞘内预注射TrkB中和抗体对骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2表达的影响与I组(0.1190.019)相比,组(0.0670.006),组(0.0700.004)大鼠脊髓背角中KCC2表达明显降低(P<TablThechangeofMWTcausedbyWalker256cellsinoculati
13、on(g.,=8)Tab2Effectofintrathecalpre-treatmentwithTrkBAbonMWTinbonecancerpainrats(g.4-.,!=8)P<0.O5,P<O.OIgroupI,#P<0.01group1IJrgroupIV中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2010Nov;26(11)1465?0.01),IU组(0.1204-0.017)和V组(0.1120.014)大鼠KCC2表达无明显差异(P>0.05);V组大鼠脊髓背角中KCC2表达明显高于组,组(P<0.01).见Fig
14、2.一一.Fig2KCC2expressiondecreasespreventedbyintrathecalpre?treatmentwithTrkBAbinthedorsalhornofspinalcordinbonecancerpainratsKCC2proteinlevelsinthespinalcordfromTrkBAbpre-treatedbonecancerpainratswerehighlyrelativetothatoflgG-all(Inonetreatedrats.Scalelmr:100xm3讨论本研究建立的大鼠胫骨癌痛模型与人类骨癌痛部分特征相似,种瘤后612d,大鼠
15、左后肢机械缩足反射阈值明显下降,其疼痛性质和持续时间与既往报道相同,证明胫骨癌痛动物模型建立成功,并提示此阶段为研究骨癌痛的理想时间窗.Coull等在2003年首次提出KCC2在疼痛的产生和维持中可能具有重要作用.正常大鼠鞘内应用KCC2拮抗剂或鞘内注射KCC2反义寡核苷酸,抑制脊髓背角KCC2活性和减少KCC2的表达,都会导致动物出现痛敏现象;外周炎症_3.或神经损伤会引起脊髓背角KCC2的表达减少;这些研究证实脊髓背角KCC2在痛敏形成过程中具有重要作用,其作用机制为:脊髓背角KCC2表达减少或活性下降,神经元细胞内氯离子浓度增高,GABA受体氯离子通道开放后,氯离子内流减少,消失甚至转变
16、为外流,致使GABA介导的抑制作用减弱,缺失甚至转变为兴奋性作用,脊髓背角神经元兴奋性增高,外周传人纤维与脊髓背角之间的联系持续性加强和扩大,对伤害性刺激敏感度增加或对正常状态下的无害刺激也会产生伤害性感受,从而形成痛敏.本实验结果显示,组大鼠脊髓背角KCC2蛋白水平进行性降低,并在时间上与肿瘤引起的机械性触觉超敏现象相一致,与先前研究结果相符,这表明脊髓KCC2表达减少可能参与了骨癌痛的形成.关于KCC2表达减少的机制,目前研究认为可能与BDNFTrkB途径有关.体外研究发现,大鼠海马组织切片在含有外源性BDNF的培养基中进行培养后KCC2的表达减少;在神经病理性痛研究中发现,坐骨神经结扎后
17、同侧脊髓背角KCC2表达减少,与此同时,BDNF表达水平则明显增加;阻断BDNFTrkB途径可以阻止神经损伤引起的KCC2表达下调,这些结果表明KCC2表达减少可能由BDNF.TrkB途径介导;此外,先前研究发现疼痛状态下脊髓背角TrkB表达也增加,鞘内给予FrkB受体抑制剂k252a或TrkBAb12能够缓解由足底注射弗氏完全佐剂或坐骨神经结扎所引起的痛敏,这些研究表明TrkB受体在炎性痛和神经病理性痛的形成过程中具有重要作用.本实验结果显示,鞘内预注射TrkBAb的骨癌痛大鼠,其脊髓背角KCC2表达水平和MWT明显高于注射IgG和不作处理的大鼠,说明阻断BDNFTrkB途径可以阻止骨癌痛大
18、鼠KCC2的表达下调并抑制肿瘤引起的机械痛敏;这提示脊髓背角TrkB在骨癌痛形成中可能具有重要作用,作用机制可能与其介导脊髓背角KCC2表达变化有关:阻断BDNFTrkB途径阻止肿瘤引起的KCC2表达下调,脊髓背角神经元细胞内仍维持相对的低氯状态,抑制性GABA能突触传递的效能处于正常水平,因此鞘内预注射TrkBAb可以抑制肿瘤引起的机械性痛觉超敏;这也进一步证实了脊髓背角KCC2表达减少对骨癌痛的形成具有重要作用;但与假手术组大鼠相比,鞘内预注射TrkBAb的骨癌痛大鼠的MWT仍有明显下降,这可能是由于其他机制如脊髓胶质细胞的活化”等也参与了骨癌痛的形成有关.综上所述,大鼠胫骨干骺端接种Wa
19、lker256肿瘤细胞可导致脊髓背角KCC2表达下调,并在时间上与肿瘤引起的机械性触觉超敏现象基本一致;鞘内预注射TrkBAb可有效阻止脊髓背角KCC2的表达下调从而部分缓解由肿瘤引起的机械痛敏.本研究表明,脊髓背角KCC2表达下调可能参与了骨癌痛的形成,BDNF一FrkB途径介导了骨癌痛形成过程.蠢一?1466中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2010Nov;26(11)中KCC2的表达下调.BDNF.TrkB.KCC2途径可能是骨癌痛形成的重要机制之一,有望成为治疗骨癌痛的有效靶点.参考文献:l1BlaesseP,AiraksinenMS,River
20、aC.CationchloridecotransportersandneuronalfunctionJ.Neuron,2009,61(6):82038.2PriceTJ,CerveroF,GoldMS,eta1.ChlorideregulationinthepainpathwayJ.BrainResRev,2009,60(1):14970.13ZhangW,LiuLY,XuTL.Reducedpotassium-chlorideco-transporterexpressioninspinalcorddorsalhornneuronscontributestoinflammatorypainhy
21、persensitivityinratj.Ncuroscience,2008,152(2):502104MileticG,MileticV.Looseligationofthesciaticnerveisassociat.edwithTrkBreceptor-dependentdecreasesinKCC2proteinlevelsintheipsilateralspinaldorsalhornJ.Pain,2008,137(3):5329.5RiveraC,LiH,Thomas-CrusellsJ.eta1.BDNFinducedTrkBactivationdownregulatestheK
22、一C1一cotransporterKCC2andimpairsneuronalC1-extrusionJ,JCellBiol,2002,159(5):74752.6杨建平,蒋豪,吴珏.大鼠脊髓蛛网膜下腔埋管并长期留管操作的改进J.中华麻醉学杂志,1993,13(2):110.6YangJP,liangH,wuJ.ImprovementofburyinganddetainingtubeforlongtimeinratsubarachnoidspaceJ.ChinJAnesthesiol,1993,13(2):110.7姚明,杨建平,王丽娜,等.腹水传代与体外培养Walker256癌细胞系建立大鼠
23、骨癌痛模型的可行性J,中华医学杂志,2008,88(13):8804.7YaoM,YangJP.WangLN,eta1.FeasibilityofestablishmentofratmodelofbonecancerpainbyusingWalker256cellsculturedinvitroorinvivoJ.ZhonghuaXueZaZhi,2008,88(13):8804.8CoullJA,BoudreauD,BachandK,eta1.TranssynapticshiftinaniongradientinspinallaminaIneuronsasamechanismofneurop
24、athicpainJ.Nature,2003,424(6951):93842.9WuLA,HuangJ,WangW,eta1.DownregulationofK.C1一co.trsalsporter2inmousemedullarydorsalhorncontributestothefor-malininducedinflammatoryorofacialpainJ.NeurosciLett,2009,457(1):3640.1ONomuraH,SakaiA,NaganoM,eta1.Expressionchangesofcationchloridecotransportersintherat
25、spinalcordfollowingintraplantarformalinJ.NeurosciRes,2006,56(4):43540.11NaritaM,YajimaY,AokiT,eta1.Up-regulationoftheTrkBrecept0rinmiceinjuredbythepartialligationofthesciaticnerveJ.EurJPharmacol,2000,401(2):18790.12YajimaY,NaritaM,NaritaM,eta1.Involvementofaspinalbrainderivedneurotrophicfactor/full?
26、lenhTrkBpathwayinthedevel?-opmentofnerveinjury-inducedthermalhyperalgesiainmiceJ.BrainRes,2002,958(2):33846.13唐元章,申文,刘苏,等.抑制小胶质细胞激活对骨癌痛小鼠疼痛维持的影响J.中国药理学通报,2009,25(1):1048.13TangYZ,ShenW,LiuS,eta1.InhibitionofnficmgliaactivationaffectedthemaintenanceofcancerpaininamurinemodelJ.ChinPharmacolBull,2009,2
27、5(1):1048.14LanLS,PingJ,NawL,eta1.DownregulationofTolllikerecep-tor4geneexpressionbyshortinterferingRNAattenuatesbonecancerpaininaratmodelJ.MolPain,2010,6:2.MechanismandexpressionofKCC2inthespinalcordofbonecancerpainratsJIAXiao.ming,YANGJian.ping,WANGLiHa,ZHONGLimin,GAOJian.1ing,XUQinian.,WANGXiuyun
28、.,ZUOJianling(1.DeptofAnesthesiology;2.ResearchUnitofNeuroscience,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)Abstract:AimToresearchexpressionchangeofpotassiumchlorideeotransporter2,(KCC2)inthedorsalhornofspinalcordinbonecancerpainratsanditspossiblemechanism.MethodsThebon
29、ecancerpainmodelwasdevelopedbyinoculatedWalker256man?maryglandcarcinomacellsintothetibiamedullarycavity.Thechangeofthemechanicalwithdrawlthresthold(MWT)andtheexpressionlevelofKCC2inspinaldorsalhorninratsatpreandpostinoculationwereobserved,andtheeffectofblockedendogenousbrainderivedneurotrophicfactor
30、(BDNF)-tyrosinereeeptorkinaseB(TrkB)pathwaybyintrathecalpretreatmentwithTrkBAbonKCC2expressionandme-chanicalallodyniawasobserved.ResultsFromthe6thto12thdaypost-inoculation.MWTwassignificantlydecreased(P<0.01),andappearedvisiblemechanicalallodynia,SpinalKCC2proteinlevelswereprogressive?lyreduced(P
31、<0.01),KCC2proteinlevelsinthedor-salhornofspinalcordandMWTfromTrkBAbpretreatedbonecancerpainratswerehighlyrelativetothatoflgG.andnonetreatedrats(P<0.01).Conclu-sionsTheseresultsindicatethatKCC2indorsalhornofSpinalcordmaybeinvolvedinthedevelopmentofbonecancerpain,andKCC2downregulationprobablymediatedbyBDNF.TrkBpathway.Keywords:tibialbonecancerpain;KCC2;TrkB;BDNF;spinalcord;allodynia
