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1、南昌大学医学院 硕士学位论文抗癌药靶向（叶酸介导）纳米给药系统的研究 姓名：刘海 申请学位级别：硕士 专业：药物化学 指导教师：朱亮 20070501 摘要 摘要目的：合成叶酸偶联牛血清白蛋白（）；制备载药叶酸偶联牛血清白蛋白纳 米粒（），并对其包封率及其靶向性进行评价。方法：、叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联。以叶酸与白蛋白的偶联 率为评价指标，运用正交实验设计优化叶酸偶联牛血清白蛋白的合成条 件。 、用去溶剂法制备纳米粒。同样也采用正交实验设计方法设计纳米粒的 制备实验，以包封率为评价指标筛选最佳的制备工艺。 、选择肺癌细胞作为靶细胞，而人骨髓间充质干细胞（）作为 正常的对照细胞。整
2、个实验分为五组：生理盐水组、砒霜组、载药 三个剂量组、叶酸阻断组、载药白蛋白纳米粒（）组。采 用，法进行细胞毒性实验。 、采用直接注射法建立小鼠肝癌模型。而后取肝癌小鼠分为三组：游离 钙黄绿素组、包裹钙黄绿素的组和包裹钙黄绿素的组， 进行体内分布实验。 、取肝癌小鼠随机分成四组：生理盐水组、包裹砒霜的组、包裹砒 霜的组、羟基脲组。尾静脉给药，进行药效实验。以生存时间 为评价指标。结果：、运用最优合成条件合成了偶联率为 的叶酸偶联牛血清白 蛋白；而在最佳条件下制备的纳米粒包封率为。细胞毒性实验显 示：当砒霜浓度为肛时，对靶细胞的抑制率为，而对 正常细胞仅为；对靶细胞的抑制率为，对萨常细胞为。 、
3、不同载体包裹的药物在体内的蓄积不同。组肝浓度峰值明显高 于组，二者峰值也明显高于游离钙黄绿素组。动物模型药效实验 显示三理赫水组小鼠生存期为，而组为： 组为；羟基脲组为。结论：采用温和条件下合成的制成的载药纳米粒，对靶细胞具有特异性 杀伤作用：，外，载药能显著延肿瘤小鼠的存期。酸偶联 摘要 白蛋白纳米粒具有主动靶向性并且该主动靶向性是通过叶酸介导的。关键词：三氧化二砷；叶酸；纳米粒；靶向性；肝癌模型 ：， （）， ， （） ， ： ， ， ， ： （ ） ， ， ， ：， ： ， ， ， ， ： ； 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工
4、作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名手写，： 每签字同期：？叩年否月， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 南昌大学 有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （
5、保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名（手写）： 劣奔 导师签名。掏：莽知签字同期：刎年 ， 多月 只 签字同期：冲月 ，学位论文作者毕业后去向：工作单位： 电话：通讯地址： 邮编： 第章引言 第章引言 肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见病、多发病，其死亡率在发达国家居第位（）、发展中国家居位（），占全球人类死亡总数的。因此近半个世纪以来攻克肿瘤一直是各国政府与科研、医疗机构的主要任务之一。化疗作为肿瘤三大常规治疗方法之一，已成为肿瘤治疗不可缺少的手段。目前临床上常用的抗肿瘤药物有多种，其中细胞毒性型药物达”种，化疗用药多以后者为主。肿瘤化疗的根本目的是在保证患者安全的情况下以药物
6、消灭肿瘤细胞，即要求所使用的药物对机体正常细胞无损害而对肿瘤细胞呈敏感的杀灭作用，达到安全、有效治愈肿瘤的目的心。然而，实际上临床使用的抗肿瘤化疗药物均有不同程度的毒副作用， 有些严重的毒副反应是限制药物用药剂量和使用的直接原因。发生这些毒副反应的主要原因在于化疗药物缺乏对肿瘤部位的特异性，大剂量给药时产生非特异性毒性，甚至对正常组织造成严重的损伤。因此，人们希望寻找出一种可以提高肿瘤组织内药物浓度而下常组织中药物浓度较低的一种治疗方法，从而减少药物带来的毒副反应。药物靶向技术就是为了解决这些问题而提出的并己成为整个药学研究领域的热点之一。 随着对肿瘤分子水平研究的不断深入，在肿瘤细胞表面或肿
7、瘤相关血管表面发现了一系列受体，它们与肿瘤生长增殖密切相关并在肿瘤组织过度表达，它们与特异性抗体或配体结合可诱导细胞内化。这种肿瘤特异性的受体为肿瘤治疗提供了靶点，把传统的化疗药物和新发现的肿瘤特异性的配体或抗体结合，可增恳锏闹琢鲅裥圆跎僖锏亩靖弊饔谩硗猓行涮謇嗨莆锟删赫种婆涮逵胧芴宓慕岷希?并在与受体结合后诱导细胞内化。”。研究发现叶酸受体在下常组织中的表达高度保守，只在肺、肾、脉络膜、胎盈中有低到中等水、表达，足在大部分恶性肿瘤巾，如卵巢癌、子寓内膜癌、肾癌、乳腺癌、 第章引言肺癌、结肠癌和鼻口癌中均高度表达或过度表达，有时可比正常组织高出”倍。 等对比研究下常细胞系和几种恶性细胞系发现，
8、恶性细胞系比正常细胞系的叶酸受体至少高出倍，最高可达倍。研究恶性肿瘤患者的活检标本，发现原发性脑瘤、肾细胞癌及大部分卵巢癌患者均高度表达叶酸受体】。 叶酸又名维生素，可还原为四氢叶酸。四氢叶酸是一碳单位转移酸的辅酶，参与一碳单位的代谢及嘌呤和胸腺嘧啶的从头合成。在生物体内，有两种内化叶酸的机制：一是低亲和力的跨膜蛋白，转运四氢叶酸和二氢叶酸进入细胞内；另一是高亲和力的糖蛋白受体即叶酸受体，吸收叶酸进入细胞内。叶酸受体收集胞外叶酸及叶酸衍生物，通过内化方式将其带入细胞，是介导叶酸进入细胞的主要途径。利用叶酸作为配体，结合药物，通过叶酸与其受体结合介导的靶向给药系统正倍受关注。 白蛋白纳米粒是以白
9、蛋白作为载体，包封或吸附药物，经过固化分离而形成的实心球体，其粒径一般”纳米（）之间，属一种固态胶体药物释放体系。白蛋白纳米载体具有高度靶向、药物控制释放、提高难溶药物的溶解度和吸收率优点，提高药物疗效和降低毒副作用阳。白蛋白是一种杰出的药物载体，具有无毒、可生物降解性，既在体内受蛋白酶的作用而降解；当药物与白蛋白结合后，可阻止药物从注射部位的释放，使药物缓慢释放阳叫。 国外有利用叶酸介导一些药物或者诊断试剂至肿瘤部位的研究；同时也有用修饰的纳米粒将寡聚核苷酸转入细胞内的研究。国内有利用磁导向的脂质体和微球方面的研究。四川大学华西药学院张良珂等人先将白蛋自制备成纳米粒，而后与叶酸偶联，再用异硫
10、氰酸荧光素对其进行标记，最后用荧光定量的方法观察肿瘤细胞射纳米粒的摄取情况，证实了可通过叶受体介导的方法将药物浓集叶酸受体丰富的肿瘤部位。 本实验拟先将叶酸清白蛋，偶联，然后进行分离纯化，进而得到。 第章引育种用于肿瘤靶向的囊材；而后将所得囊材制备成包裹有砒霜的纳米粒，并在细胞水平和肿瘤模型动物体内研究其对肿瘤的主动靶向性及其药效作用。 第章材料和办法 第章材料与方法实验材料、试剂及仪器实验动物： 小鼠购自于广东省医学实验动物中心（合格证号：粤监证字）细胞株： 人肺癌细胞株购于武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心 小鼠肝癌细胞购于中山大学实验动物中心 人骨髓间充质干细胞分离自正常人骨髓血（
11、骨髓样本由一附院血液科提供）主要试剂： 牛血清白蛋白 上海新量化工试剂有限公司 叶酸 上海新量化工试剂有限公司 碳二亚胺盐酸盐（） 上海三杰生物技术有限公司 戊二醛溶液 中国医药集团上海化学试剂公司 三氧化二砷 上海化学试剂采购供应站 培养基 公司 无叶酸 培养基 公司 胎牛血清（） 杭卅四季青生物公司 公司 胰蛋白酶 公司 公司 钙黄绿素 上海试剂厂。主要仪器设备： 第章材料和方法 电子天平 德国公司 型数显恒温水浴箱 常州国营华东电子管厂 恒温磁力搅拌器 金坛市富华仪器有限公司 离心机 上海安亭 旋涡混合器 上海精科 超声细胞粉碎机 宁波新芝 超净工作台 苏州净化设备厂 恒温：培养箱 型酶
12、联免疫检测仪 国营华东电子管厂 透射电镜 荧光分光光度计 上海三科仪器有限公司 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司实验方法叶酸偶联牛血清白蛋白的制备，分离以及偶联率的测定叶酸偶联牛血清白蛋白的合成与分离 将叶酸溶于的磷酸缓冲液（）中，加入后于磁力搅拌器上搅拌活化分钟，再加入 牛血清白蛋白的溶液，搅拌下反应数小时即得引。将反应液过 一柱，收集前段淡黄色有乳光部。冷冻干燥即得。叶酸标准曲线的测定 精密称取叶酸 ，用的定溶于 的容量瓶中，得的叶酸标准溶液；分别吸取叶酸标准溶液、 于个 的容量瓶中，用的定容至刻度，用的作空白对照，在 处测紫外吸收。绘制叶酸标准曲线。偶联率的测定 将叶酸偶联牛
13、血清白蛋白溶于的中，加入适量的胰篮白酶溶液，于水浴中消化 后，离心取上清液在 处测紫外吸收。计算叶酸的赜，最后汁算出叶睃的偶联率（）。 偶降丽鬻器酱 第章材料和方法 合成条件的筛选 叶酸偶联率越高，纳米粒对肿瘤的靶向性就越高。为了获得具有较高偶联率的叶酸偶联白蛋白。经查阅相关文献和大量的预实验，本实验最终确定考察叶酸用量、与叶酸摩尔比、反应时间三因素，并进行三因素三水平正交实验，。以偶联率为考察指标，筛选最佳合成工艺。用统计软件，进行三因素三水平正交设计资料的方差分析（见表）。 表因素水平表载药白蛋白纳米粒的制备砷标准曲线的测定矧 精密称取干燥恒重的三氧化二砷 ，加入 溶液（ ），加热溶解后定
14、容至 ，即得炫的砷标准储备液。取砷标准储备液 ，加入 几的：。 ，定容至 ，即得 的砷标准工作液。 分别吸取砷标准工作液（ ）、 于砷化氢发乍瓶中，加蒸馏水至 ，于各发生瓶中分别加入硫酸 ， 碘化钾溶液 ，摇匀后水浴保温分钟，再加入 ：溶液（临用时配置） ，充分摇匀水浴保温分钟后，加入无砷锌粒 （同一批弓），立即接卜塞有乙酸铅棉花的导管并插入有 吸收液的吸管中（接用水封），水浴反应小时，产尘的砷化氰用吸收液（ 第章材料和力法： 一：乙醇为：）吸收，测定各管吸收液。值，重复次，计算砷标准曲线和相关系数。钙黄绿素的荧光扫描和标准曲线的绘制 用值的磷酸缓冲液配制钙黄绿素溶液。于荧光分光光度计下选择激
15、发波长为 ，而发射波长选择 一 之间进行扫描。选择合适的发射波长进行荧光定量实验。 精密吸取。 的钙黄绿素溶液、 于 的容量瓶中，用值的磷酸缓冲液稀释至刻度。选择激发波长 ，发射波长为 测定荧光强度。绘制钙黄绿素的标准曲线。白蛋白纳米粒的制备 将：。用少量 溶液加热溶解后冷却，再将牛血清白蛋白溶于其中，待完全溶解后调节值微碱性，室温下缓缓（逐滴）加入无水乙醇，搅拌半小时待溶液出现混浊后再缓缓加入戊二醛溶液乜引，继续搅拌固化 。将反应液倒入离心管中，于离心机（ ）中离心，用水反复洗三次后，真空干燥。 将钙黄绿素溶于牛血清白蛋白的水溶液中，然后同上操作，制各载有钙黄绿素的白蛋白纳米粒。纳米粒的形态
16、和粒径检查 取一定量的纳米粒于吐温水溶液中超声分散一段时间后，在 透射电镜下拍照。包封率的测定 称取三氧化二砷白蛋白纳米粒 分散于胰蛋白酶水溶液中，水浴中消化 后，于 离心分钟后，精密吸取上清液再稀释。取一定量的稀释液加入砷化氢发生瓶，用新银盐法测定砷的含量，根据标准曲线计算砷的浓度，并根据稀释倍数计算砷的总浓度。 白蛋自纳米粒中。含量 包封率一 。 ：。投药量空白回收率和加样回收率的测定 空白叫收率的测定：精密吸取 砷标准储备液（ ）和 空白纳米粒，加入 胰蛋白酶溶液在水浴中消化 后，加水至 ，于 离心分钟，精密吸取：清液以：的比例蒸馏水稀释定容， 第章材料和方法 空白回收率朵蠹警取 稀释液
17、新银盐法测定砷含量。 加样回收率的测定：称取三氧化二砷白蛋白纳米球 ，按照包封率的测定方法测定砷含量。精密吸取砷标准储备液 和已测定浓度的载药纳米球 ，加入 胰蛋白酶溶液在水浴中消化 后，加水至 ，于 离心分钟，精密吸取上清液以：的比例用蒸馏水稀释定容。 加样回收率笪堕垒专磊嚣考产。溉取稀释液用新银盐法测定砷含量。 砷的加入量纳米粒制备条件的优化 白蛋白纳米粒的包封率越高，则发挥治疗作用需要的纳米粒的量就越少：另外包封率也是纳米粒质量评价的一个重要指标。经查阅相关文献和预实验最终确定选择：。用量、牛血清白蛋白的浓度、乙醇与溶液的体积比三因素各取三水平进行工艺优化（见表）。以包封率为评价指标畸硼
18、。 表因素水平表，细胞毒性实验细胞培养与实验分组删 肺癌细胞，以含 青霉索、 。链霉素、的 第章材料和方法培养液，在、含体积分数为的饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。 人骨髓日充质于细胞，取出加入抗凝剂的正常骨髓血 和 含胎牛血清的生长液混合后。置于含体积分数为的、孵箱中培养，待到在显微镜下观察有明显细胞贴壁时换液，细胞长满培养瓶后传代，“别。取对数生长期的细胞进行实验。 本实验分为五组：生理盐水组（正常对照组）、砒霜组、载药白蛋白纳米粒组、载药叶酸偶联白蛋白纳米粒组（高、中、低浓度），以及叶酸阻断组，进行细胞毒性实验。绘制肺癌细胞和细胞生长曲线（法） 将细胞接种于个孔培养板中
19、，每板接种孔，另平行设一实验孔只加培养液，用于测定时作为调零孔；细胞接种密度约个，每孔加入细胞悬液，分别继续培养、和 ，每个时间点各取一板用于实验测定。 每孔加入（ ） ，继续培养 后终止培养，小心吸出孔内上清液，每孔加入 ，用震荡混合仪震荡 ，使结晶充分溶解。 选择 波长酶标仪测定每孔光吸收值（屯）。以时间（）为横坐标， 光吸收值（。）为纵坐标作图绘制细胞生长曲线。细胞毒性实验 将细胞接种于个孔板中，细胞接种密度约个，每孔加入肛细胞悬液，继续培养几天后进入对数生长期，用于实验（用无叶酸 培养液在加药前一天换液阳）。 每组均设个平行复孔以及个调零孔，加入对应组的溶液 。两块培养板按同样方法操作
20、。分别培养 和 ，到终止培养前 ，每孔加入 （ ） ，继续培养 后终止培养，小心吸出孔内上清液，每孔加入 肛，用震荡混合仪震荡 ，使结晶充分溶解。用酶标仪选择 波长测定每孔光吸收值（凡）。按公式计算各孔细胞抑制率。 抑制率（一磊磊百 实验组。帅值 吣 。 统计软件，对箨组巾的细胞抑制率用两两比较的榆验处理， 第章材料用方法检验水准为。动物体内靶向性及药效实验小鼠肝肿瘤模型的建立 将肝癌细胞复苏、传代繁殖到一定数量后，调整细胞浓度至个注入小鼠腹腔内，按正常饲养方法继续饲养，约个星期后小鼠腹部明湿大于正常小鼠滔嬲。处死小白鼠，取其体内腹水，于 离心 后，吸取上清，下层浓稠物用上清液按：稀释，抽入
21、的注射器内备用。 小鼠以的乌拉坦腹腔麻醉后汹删，取仰卧位，自剑突下沿腹中剪去体毛，用碘酒消毒后开腹，最后暴露小鼠腹腔，轻压小鼠胸腔使肝脏跳出腹腔，选取左边肝叶种植肿瘤。左手轻央小鼠肝叶，右手持抽有癌性腹水的注射器，注射针头斜行进针，刺入肝脏约 左右，轻推注射器针芯，注入经过稀释好的癌性腹水 。拔针后，助手立即用棉签按压穿刺点约” 后，观察沿针道无活动性出血后，轻送肝脏还纳腹腔，逐层关腹。 接种肿瘤后的小鼠按正常饲养方法继续饲养，并每天注射庆大霉素注射液消炎。天后随机处死小白鼠只，取其肝脏，肉眼观察并进行病理切片。叶酸偶联白蛋白纳米粒的肿瘤靶向性 取造好肝癌模型的小鼠只，随机分成三组，肌：游离钙黄绿素组（组）、包裹有钙黄绿素的组（组）、包裹有钙黄绿素的组（组）。每组均按钙黄.
