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1、Realtime PCR的原理和应用,Yang Sun,PhDProduct Specialist,主要内容,Realtime PCR的原理Realtime PCR的应用Realtime PCR的问题及解决方法,Real Time PCR的概念,Real time PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。,Ct值扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。,理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模
2、板量Ex：扩增效率,Real time PCR的原理,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M(3)最后结论：Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量,Real time PCR的原理,Real Time PCR的方法,染料法 使用内掺式染料-SYBR Green I 探针法 使用序列特异性探针-Ta
3、qman-Molecular Beacons-Dual Probes(FRET),SYBR GREEN法,Real Time PCR的方法,SYBR-Green 的优点 使用方便-不必设计复杂的引物 没有序列特异性-可以用于不同的模板 便宜 灵敏 SYBR-Green 的缺点 特异性差，会与非特异性产物结合,Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性-特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设计相 对简单Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析,Real Time PCR的方法,分子信标的优点对目标序列有很高的特异性 用于SNP检
4、测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高,Real Time PCR的方法,Real time PCR数据处理方法,绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，标准曲线法,Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M,将正对照模板按照10倍进行稀释并且进行PCR，将所得的Ct值进行作图，所得的斜率为S，则：影响效率的因素为：引物、镁离子以及探针的浓度,PCR效率的计算方法,Real time PCR数据处理
5、方法,绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物含有已知数目的与待测样品相同的扩增片段的细胞,Cited from Clinical Chemistry 48:811781185(2002),Real time PCR数据处理方法,Real time PCR数据处理方法,2 delta-delta Ct,主要内容,Realtime PCR的原理Realtime PCR的应用Realtime PCR的问题及解决方法,Realtime PCR的应用,定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴
6、定 SNP分析病原菌检测药厂GMP认证突变测定物种鉴定,主要内容,Realtime PCR的原理Realtime PCR的应用Realtime PCR的问题及解决方法,Real time PCR的问题及解决方案,该选择绝对定量还是相对定量？绝对定量的问题：费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的
7、样本，这样也就使实时PCR的高通量有所降低。由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。,若选择绝对定量则应该注意：选择与样品具有完全相同序列的标准品每次进行实验时尽量使用新鲜配制的标准品尽量选用完全相同的体系若选择相对定量则应该注意：选择合适的看家基因，通常可供选择的看家基因包括GAPDH、-actin、2-微球蛋白和rRNA尽可能测定扩增效率,Real time PCR的问题及解决方案,Realtime PCR引物设计原则,引物应该非常特异T
8、m在5865之间GC含量在3080不要有连续的相同的碱基，尤其是G如果有超过4个连续的G则此引物不可用3末端最后5个碱基中不能含有超过两个的G或C两条引物的退火温度应该尽量接近避免引物二聚体以及发夹结构产物在100150bp之间最大不能超过200250bp若测定cDNA的含量时设计的探针最好时跨内含子的应该选择至少时经过PAGE纯化的引物,Tm比引物高810度G不能在5端碱基C的数量要大于G的数量G连续必须小于4个GC含量2080%探针长度9到40个碱基探针不能自身形成发夹结构或者不能和引物形成二聚体,Realtime PCR探针设计原则,杂交探针需要注意什么？在使用杂交探针进行实验时，必须注
9、意防止探针引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。,Real time PCR的问题及解决方案,循环数为多少比较合适？一般的实时定量PCR反应只须2530个循环便可获得满意
10、的结果，但是对于那些极微量的待测样本而言，适当增加循环数可以提高反应的检出限，有文献报导当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。但是并非循环数增加得越多，其敏感性就会越高，实际上，当循环数增加到某一值时，敏感性便不再升高，因为循环数并不是影响敏感性的唯一因素，而且在实验过程中，也不可能因为增加敏感性而无限制地增加循环数，这不仅是实践中行不通，而且在理论上也不可行，因为随着循环数的增加，一方面，聚积的产物会抑制Taq酶的活性，另一方面，也会增加形成异源二聚体的可能性，这些都会影响到最终的定量结果。,Real time PCR的问题及解决方案,Mg2的浓
11、度如何进行优化？Mg2+浓度对敏感性的影响主要存在于两方面，首先，Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2+的浓度无法达到使Taq酶发挥最佳活性，无疑将会影响到实时定量的敏感性；其次，Mg2+的浓度过高，会增加引物二聚体的形成，从而导致敏感性降低。不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Ct值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择25mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RTPCR而言，则应选择的浓度为48mM。,Real time PCR的问题及解决方案,模板的浓度多少合适？如果研究
12、者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Ct位于1530个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Ct小于15则应选择较低的模板深度。对于Ct值的确定，经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。基因组DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右选择。,Real time PCR的问题及解决方案,引物的浓度如何选择？引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完全，若
13、引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.5uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.31.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。退火温度怎么设计？首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5，然后在12内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距。,Real time PCR的问题及解决方案,杂交探针的浓度如何设置？初实验用0.2 uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。荧光域值（threshold）如何设定？PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省
14、设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SD(cycle 3-15),Real time PCR的问题及解决方案,Real time PCR的问题及解决方案,Realtime PCR所使用的核酸的纯度要求要求尽量的纯可以使用市售的试剂盒进行纯化如果使用酚氯仿的方法需要注意：残余的酚会影响逆转录的效率并且使RNA的值偏高（使用紫外测定的时候）可以使用DNAase来处理RNA但是如果使用一些探针进行实验的时候需要注意后续的去除或者灭活。,Real time PCR的问题及解决方案,利用Realtime PCR定量RNA的时候需要注意什么?反转录最好使用基于M
15、MLV使用随机引物的方法来反转录总RNA。随机引物的倾向性最小，如果使用序列特异性的引物或者OligodT的话RNA的二级结构以及PolyA的长度会影响其偏向性。并且限制了18sRNA在相对定量中的应用。尽量采取两步法而不要使用一步法反转录因为两步法能够尽量少操作容易降解的RNA。一步法由于酯的堆积以及溶液成分的缺少会造成低表达量的基因的转录被高表达量的基因的转录抑制。设计的引物和探针需要跨内含子,Real time PCR的问题及解决方案,Realtime PCR的重现性很差怎么办？PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响
16、到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成
17、、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。,Real time PCR的问题及解决方案,Realtime PCR的重现性很差怎么办？如果有可能尽量选择体积较大的测试体积（50l)。避免人为地失误（错加，漏加等)如果可能尽量选择板子中间作为实验孔反应之前进行离心以便消除泡沫和粘挂在管壁上的样品重复孔，并且使用Master mix加入管家荧光ROX,Real time PCR的问题及解决方案,非特异性的信号怎么解决？反应体系中形成的引物二聚体非特异性扩增由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出
18、现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的或者非特异性扩增的形成，但是在定量检测时，它却可以避开二者的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号。可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体和非特异性扩增是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少二者的形成要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。,Real time PCR的问题及解决方案,非特异性的信号怎么解决？如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。读取荧光信号的时候采用高于因物而聚体的熔解温度来读取。,人为问题（漏加、错加）非特异性扩增以及引物二聚体各种条件的优化时间很长解决方法：明显的加样指示剂热激活的酶已经优化好的条件,Real time PCR的问题及解决方案,Contact us,www.AB 800-810-0242Y,QA,
