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1、第五章 基因诊断和基因治疗,基因诊断,应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断的诊断技术,诊断技术进展,细胞学检查：第一代，早期生化指标分析：第二代，50年代免疫学诊断：第三代，60年代 以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代 直接以病理基因为探查对象,基因诊断 的优点,早期诊断：被检测的基因是否处于活化表达状态并不重要。因此，基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可产前早期诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜伏期的病原微生物、还可能予测和早
2、期发现某些恶性肿瘤。灵敏度高：可从人类长达3106kb的基因组中检测单拷贝基因，可检出某一基因的单碱基改变。,基因诊断的基本技术,一、核酸分子杂交技术,核酸分子杂交系指不同来源的两条互补核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。核酸分子杂交发生于两条DNA单链之间者（ssDNA:ssDNA）叫DNA杂交。发生于RNA链与DNA单链之间者（RNA:ssDNA）叫做RNA-DNA杂交。将一段已知的带有标记物的核苷酸序列（核酸探针）与待测DNA/RNA杂交即可测知致病基因的存在状态。,（一）原位（in situ）杂交,不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片
3、上）和细菌菌落（复印至泸膜上）与标记核酸探针杂交。可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。,（二）斑点印迹（Dot blot）杂交,把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸探针杂交。可检测特定基因的存在或表达情况。,Southern印迹杂交,系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后，再转移至膜上与标记探针杂交的一种核酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物总基因组中的单拷贝基因。主要用于检测基因组中特定的基因或序列。,Northern印迹杂交,是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记核酸探针杂交的技术。是分析
4、基因表达水平的主要技术之一。它可定性、定量测知某一特定基因的表达情况。,二、PCR技术,（一）DNA PCR,以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。主要用于检测特定基因或DNA片段的存在。并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。,（二）RT-PCR,用提取的mRNA或总RNA（含mRNA）为模板，逆转、扩增cDNA。是检测特定基因表达水平的主要方法之一。也是用于鉴别、诊断RNA病毒的重要技术。,（三）PCR-SSCP,该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基）有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSC
5、P)。这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序列有无变异。在基因诊断中它常与核酸序列分析配合完成基因突变分析。即先用PCR-SSCP进行大批量筛查。筛出有突变的样本（PCR产物）再测序即可明确该基因的突变性质。,（四）原位PCR,直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR反应，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。既能鉴定含有靶DNA/RNA序列的细胞；又能确定靶DNA/RNA序列在细胞内或染色体上的位置。,（五）多重PCR,系在一次PCR反应中加入多对引物，同时
6、扩增DNA链上不同序列段的一种PCR技术。主要用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。DMD：9对扩增引物加入一次PCR反应体系中，同时扩增9个外显子序列。由于扩增产物片段大小不一，只需琼脂糖凝胶电泳、EB染色即可直接观测有无某一外显子区带缺失。是诊断基因缺失型的一种简便、快速、有效的基因诊断方法。,（六）定量PCR,PCR产物经凝胶电泳分离转移至膜上，与同位素或化学发光标记的核酸探针杂交。根据放射自显影或化学发光后底片曝光的强弱，用密度计扫描定量。有条件者，PCR产物经凝胶电泳分离后勿须转移和杂交，直接于自动凝胶分析仪上扫描定量。最为简便、快速。定量PCR在基因诊断中也是应用较广，有时甚至是不
7、可缺少的。,三、DNA序列分析,DNA测序是直接分析待测基因核苷酸序列的方法。是基因诊断中最为直观，准确可靠的技术。只是由于测序工作还较费时，经费亦较贵尚不能普遍应用。但随着DNA自动测序仪的快速发展和测序工作日趋商业化，将大大促进DNA测序的临床应用。,四、RFLPS分析,限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism,RFLP)是由于某些个体DNA链中核苷酸序列发生变异的结果。这种变异使某些限制性内切酶消化产生与正常个体者不同的DNA片段长度。当这些变异影响到基因的正常功能时，往往是致病性的。RFLP主要有以下两种类型：点多态性 序列
8、多态性,1.点多态性,表现为DNA链中发生单碱基突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。这类多肽性实际是双态的，即有或无酶切位点。据此，样品DNA经特定内切酶消化和Southern印迹杂交即可诊断某些疾病。,2.序列多态性,DNA链内发生较大片段的缺失、重复、插入等变异。结果，内切酶位点本身碱基序列虽未改变，但原有内切酶位点在基因组中的相对位置改变了从而导致RFLP。亦可用Southern印迹杂交诊断相关疾病。,基因诊断的应用,一、遗传性疾病的基因诊断,针对某一遗传病的发生机理，通过基因诊断技术进行携带者检查、产前早期诊断，采取有效措施杜绝患儿出生，降低该遗传病基因的发生
9、频率具有极积的现实意义。,二、病毒性疾病的基因诊断,只要掌握了病原体的基因结构，几乎所有的原病体都可用基因诊断方法检出。无论设计合成杂交探针或PCR引物序列，应选择来自病毒基因组核酸保守序列。典型保守序列编码的蛋白质往往是病毒生命周期中的重要功能蛋白，特异性更强。,三、寄生虫病的基因诊断,由于寄生虫的基因组结构功能远比细菌、病毒复杂多样。因此，一种寄生虫能否采用基因诊断，则取决于在其宠大的基因组序列中能否找到特异的靶序列。根据这些靶序列才能设计制备特异性的杂交探针和PCR引物。目前用基因诊断可检测的寄生虫有恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、马来丝虫、血吸虫、弓形虫等。,四、基因诊断在法医学中
10、的应用,法医学中对生物样本检测的主要目的是达到个人识别和亲子鉴定 80年代以来，以核酸分子杂交和PCR技术为核心的基因诊学的迅速发展，有逐渐取代传统法医物证鉴别法的趋势 法医学基因诊断的分子基础是基于人类基因组结构中存在一些可作为个体特征标示的序列,个体特征标示序列,可变数串联重复序列短串联重复序线粒体DNA非编区,（一）可变串联重复序列多态性分析,可变串联重复序列（VNTR）属高度重复序列 VNTR内的“核心序列”（重复单元）长10-70bp。不同个体基因组上同一VNTR位点的核心序列相同，但重复次数相差悬殊。故不同个体间同一位点VNTR区DNA片段长度变化较大，在群体中呈多态性，即VNTR
11、长度片段多态性。NVTR长度片段多态性就为法医学中的个体识别提供了有力证据,VNTR长度片段多态性的检测方法,DNA指纹图谱法 扩增片段长度多态性（Amp-FLP）,1.DNA指纹图谱法,利用VNTR序列中无切点的限制性内切酶如Hinf I，酶切基因组DNA后，形成长短不等的许多DNA片段。电泳分开不同大小的DNA片段。用VNTR核心序列作为标记探针进行Southern印迹杂交。不同个体出现一系列不同的杂交带型。从而做出个体识别或指证确认罪犯。,2.扩增片段长度多态性,其基本原理是设计一对与VNTR区两侧保守区互补的PCR引物，对VNTR区DNA进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶
12、电泳、EB/AgNO3染色即可直接判型,（二）短串联重复序列多态性分析,短串联重复序列（Short tandem repeat,STR）又称微卫星DNA。STR是由2bp-10bp重复单元组成的短串联重复序列。片段长100bp-500bp。STR广泛分布于人类基因组。据估计，人类基因组每20kb就有一个3bp或4bp串联重复序列的STR位点。STR用于法医学检测，具有以下优点：不需要杂交。只要设计出STR两侧DNA引物对待检样本DNA进行简单的PCR，即可根据电泳谱带认定或排除罪犯。由于STR广泛分布于整个基因组，可分析部分降解的DNA。STR序列较短，各位点STR扩增条件相差不大，可对几个S
13、TR位点进行同步扩增，即STR-PCR复合扩增技术，以省时、节约检材、提高识别机率。,（三）PCRmt DNA分析,mt DNA存在于细胞质中。其遗传方式为母系遗传。一个细胞一般含有数百个线粒体，而每个线粒体则含有210个mt DNA拷贝。一个细胞可达几千个mt DNA拷贝。mt DNA分析的灵敏度要比DNA高。研究表明，不同个体mt DNA非编码区D环附近序列存在着明显差异。用PCR扩增、测序，可进行个人识别。,基因治疗,将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗疾病的目的,基因治疗的策略,基因置换就是将致病基因整个地换以正常基因，使致病基因永久地得到更正。基因修正是指将致病基因的突变碱
14、基序列纠正，而正常部分予以保留。基因修饰是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物饰变缺陷细胞的功能或使原有的功能特别加强。基因失活就是应用反义技术（antisense technology）特异封闭某些基因，以达到抑制某些有害基因的表达,基因治疗的程序,目的基因的获得，靶细胞的选择以及将目的基因导入靶细胞的高效手段,一、目的基因的获得,目的基因可以是染色体基因组，也可以是互补DNA，即cDNA。基因的人工合成基因的多聚酶链反应扩增（polymerase chain reaction,PCR）以及人体基因组的降解基因的克隆化,二、基因治疗的靶细胞,基因治疗的靶细胞有两类，即生殖细
15、胞和体细胞。现今基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变也仅影响某个体当代。基因治疗中，选择什么样的细胞作为基因转染的靶细胞，是基因治疗成功与否的一个重要途径。选择时除要考虑疾病本身的特点外，还要考虑目的基因及其转移方法等因素。选择时要考虑：,（一）发病的器官及位置,根据表现基因缺陷的器官及其位置来选择基因治疗的靶细胞。可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如肝脏病的基因治疗中，可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞，同时肝癌的治疗，也可选择肝癌组织中浸润的淋巴细胞作为其靶细胞，有时甚至肿瘤细胞也作为靶细胞的候选对象。,（二）发病机制,家族性高胆固醇血症（FH
16、）患者，血中胆固醇水平很高，绝大部分在20岁之前就发展成为严重的动脉粥样硬化而致死，但其病因却是肝细胞膜上缺乏低密度脂蛋白受体（LDL-R），肝细胞摄取血中胆固醇的能力下降或完全丧失，造成低密度脂蛋白的代谢障碍。因此，FH病人如进行基因治疗，应选择肝细胞作为靶细胞，导入LDL-R的基因，使肝细胞膜上的受体得到表达，提高其对血中LDL的处理能力。,（三）体内屏障结构,血脑屏障的存在，可阻挡许多大分子物质进入中枢神经系统。中枢神经系统的疾病进行基因治疗要保证选择的靶细胞中目的基因表达产生可在中枢神经系统发挥作用。一方面选择中枢神经系统本身的细胞种类作为其基因治疗的靶细胞，也可将其他部位的细胞转化后
17、进行中枢神经系统移植。总之要避开血脑屏障对目的基因表达产物运输的障碍，目的基因表达产物进不了中枢神经系统，往往很难发挥其作用，而达不到基因治疗的目的。,（四）容易取出和移植,最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞种类。人的血液红细胞（RBC），淋巴细胞，造血干细胞都是人类基因治疗的合适靶细胞种类。肝脏等实体器官的细胞可以利用外科手段取出，但肝细胞的移植却是个难题。无论肝细胞的原位移植还是异位移植，存活率均十分有限，限制了这些实体器官细胞作为基因治疗靶细胞的应用。皮肤细胞，特别是成肌细胞也是很有前途的靶细胞种类。血管及有腔器官的内皮细胞也是较为常用靶细胞种类。,（五）容易在体外培养,作为基因治
18、疗的靶细胞要求在体外培养的条件下容易存活，而且要有一定的分裂和自新能力，因为一般情况下基因治疗要求的转导细胞数量在108-1012以上 绝大多数血液细胞都是终末分化的细胞，体外培养无繁殖能力。RBC的寿命也就是四个月左右。淋巴细胞的体外培养还需要白细胞介素2（IL-2,interleukin2）或有丝分裂原，如PHA等的不断刺激。尽管骨髓干细胞（BMSC，bone marrow stem cell）具有良好的分裂能力，但在血液细胞中的总数中占比例很小，还不到0.05%。但无论如何，很多种血液系统疾病，特别是一些常见的血液系统单基因遗传病，BMSC还是人们希望的靶细胞种类。,（六）容易被转导,转
19、导靶细胞的基因转移（gene transfer）手段包括物理法、化学法、融合法及病毒载体法四大类。一般来说，MoLV改建的逆转录病毒载体对处于活跃分裂状态的细胞感染率和基因转移效率较高，而对终末分化的，分裂不十分活跃的细胞的感染率和基因转移效率较低。因此，基因治疗中要尽力选择那些处于活跃分裂状态下的细胞作为基因治疗的靶细胞，至少也应选择那些体外培养过程中经适当刺激能进行活跃分裂的细胞。,（七）具较长的寿命,基因治疗，特别是某些单基因遗传缺陷性疾病的基因治疗，最终目的要求外源基因是长期、稳定的表达，甚至是终生的。因此，要使基因治疗的靶细胞必须具有较长的寿命。,三、基因转移系统,1.一般理化方法介
20、导的基因转移,（1）DNA磷酸钙共沉淀,DNA与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞的吞饮作用进入细胞质，然后进入细胞核并整合到染色体上。该方法的优点是目的基因的制备比较容易，只需经过扩增后纯化，不必构建复杂的载体。不足之处是效率低，仅可用于体外细胞的基因转移及DNA的随机性整合。,（2）多聚阳离子（polycation）或脂质体-DNA复合物,多聚阳离子如多聚赖氨酸（polylysine）带正电荷，可与带负电荷的DNA分子结合；脂质体是由脂质双层分子组成的环形封闭囊泡，无毒、无免疫源性，DNA被包裹于其中。这种脂质体外壳可使DNA保存完整，通过一种内吞噬过程进入细胞。另外，还可将脂质体与某些抗体结合，
21、形成具有导向性的免疫脂质体，将DNA定向引入特定细胞。,（3）电穿孔法,电穿孔法是将外源DNA和受体细胞充分混匀后，在外部高压短脉冲作用下使受体细胞膜出现瞬间可逆性的孔隙，一定大小的DNA分子经过孔隙进入细胞。这种方法具有简便、快速、对质粒DNA纯度要求不高等优点，但高压电激可杀死部分细胞，故必须在体外进行，使该法的应用受限。,（4）哺乳动物人工染色体技术,人工染色体可以被认为是一种在细胞中可以进行复制、分离及表达所携带的基因片段。这些人工染色体可作为一种运载体，它可以携带那些有自身调节序列的大片段DNA进入细胞内，在细胞内以一种染色体外多余染色体形式存在由于是染色体外进行复制，这种单拷贝的非
22、整合形式的实体不易引起“插入突变”。由于它的大容受能力可携带包括控制基因表达的序列，所以基因的表达调控将接近生理水平,2、病毒载体基因转移系统,逆转录病毒载体（1）,多为小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus,Mo-MuLV）宿主范围：单向性（只能感染啮齿类动物细胞）双向性（可感染啮齿类到人类）,逆转录病毒载体（2）,为保证重组病毒载体进入体内后不产生野生型病毒颗粒，重组载体在结构上已删除了gap、gol、env基因（代之以外源基因），仅带有组装病毒颗粒的包装信号（），因此是复制缺陷型病毒载体（replication-deficient viral vect
23、or,RDV）。需要在含有辅助病毒的包装细胞中，包装成假病毒颗粒。,逆转录病毒载体（3）,RV载体有一定局限性RV只能整合处于增殖状态的细胞容纳的外源基因需小于8kb随机整合的“插入诱变”危险性。,腺病毒载体（1）,腺病毒（Ad）为较大的双链线状DNA，基因组约36kb。Ad通过受体介导的内吞作用进入细胞内，其外壳在细胞内粒中降解，然后其基因组移位至细胞核。在细胞核中Ad并不整合于细胞染色体，而是以染色体外成分（extrachromosomal element）存在。Ad对于上皮细胞、角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的嗜向性。目前所用Ad载体已将其基因组E1和E3区删除，删除区域可容纳7kb的
24、外源基因。重组Ad的包装是通过稳定转染了Ad E1和E3基因的细胞系（293细胞）完成。,腺病毒载体（2）,局限性：免疫源性，目前有报道利用Cre-loxp重组构建“无内脏（gutless）”Ad载体可望解决Ad载体的免疫源性。缺乏特异性：Ad载体的另一缺点是它几乎可以感染所有细胞，而缺乏特异性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。优点：不整合进入宿主细胞基因组,腺相关病毒载体,AAV比较小，基因仅为4.7kb，非常稳定，可以感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。野生型AAV定点整合于宿主细胞19号染色体长臂某一固定小区域。至于这种定点整合是否较随机整合更具安全性尚未清楚，有待进一
25、步探讨。,单纯疱疹病毒载体,HSV是约150kb的大DNA病毒，这类病毒的特性是对神经系统具有嗜向性，可在神经元中建立终生潜伏性感染。故这类病毒载体有利于将外源基因导入中枢神经系统细胞内，用于帕金森病或脑瘤等神经性疾病的治疗。HSV能够感染有丝分裂后细胞，包括神经元，这是HSV载体的一些优点。,表15-10 常用基因转移方法比较,基因治疗的方法,一、代偿性基因治疗,通过对有代偿功能的基因的正调控，开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如：以某些作用剂提高或珠蛋白基因的表达以治疗地中海贫血。,二、补偿性基因治疗,即把正常基因导入体内并表达以被偿缺陷基因表达的不足或缺无。这就是目前正在使用于治疗A
26、DA缺陷症、乙型血友病的体细胞基因治疗策略。,三、替换性基因治疗,这种以正常基因原位地替换缺陷基因的策略最为理想，但目前还只停留在细胞水平的同源重组的研究阶段，离实际应用于临床还要走一段较长的路。,四、性细胞基因治疗,即性细胞或胚干细胞补偿性基因治疗。它是更为有效的基因校正方式，涉及技术复杂，受伦理道德的限制，只在动物实验上进行研究，目前还不能应用于临床。,五、调控性基因治疗,通过导入编码调控蛋白的基因以治疗基因表达异常的疾病，例如：以野生型p53基因治疗肺癌或急性白血病。此种方式已进入初期临床阶段。,六、反义性基因治疗,以反义寡核苷酸或表达反义mRNA的载体导入细胞以在到校正基因异常表达。例
27、如：对癌基因或微生物基因表达的抑制，以治疗疾病。这一领域研究得十分活跃，但尚无临床应用的报道。,七、活化前体药物性基因治疗,即导入能使无细胞毒性药物转化为有毒性药物的酶基因，以杀伤瘤细胞治疗肿瘤。此种策略已被批准进入临床。,八、免疫性基因治疗,即导入能使机体产生抗病毒或肿瘤免疫力的基因以达到治疗的目的。例如：B7辅助刺激因子基因，各种淋巴因子基因的导入和表达，或直接注入抗原基因等。此种策略花样繁多，亦已被批准进入临床。,九、抗细胞毒性基因治疗,将具有产生抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力，提高肿瘤的治愈率。例如：导入二氢叶酸还原酶基因，以耐受MTX的化疗，导入mdr-1基因以耐受多种化疗剂等。,十、特异性细胞杀伤,利用DNA重组技术可造成以特异性杀伤靶细胞为目的“神奇弹头（magic bullet）”，在基因治疗实验中特异性杀伤肿瘤细胞。“弹头”部分是通过分子重组的各种生物来源的细胞毒素，它们以酶催化方式发挥作用，所以毒性很强。例如，绿脓杆菌外毒素（pseudomords exotoxin,PE）、白喉毒素（diphtherid toxin,DT）、蓖麻毒蛋白、天花粉、以及真菌毒素-sarcin。它们的作用是抑制蛋白合成，从而造成细胞杀伤。,
