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1、课题3 酵母细胞的固定化,专题4:酶的研究与应用,课题目标,课题重点、难点 重点：制备固定化酵母细胞;难点：制备固定化酵母细胞;,1、说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理;2、尝试制备固定化酵母细胞,并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。,背景知识,1、酶制剂的概念和种类,（一）酶制剂,含有酶的制品,（1）定义：,（2）种类：,液体酶制剂：治疗胃病的胃蛋白酶液,固体酶制剂：多酶片、加酶洗衣粉中 的蛋白酶和脂肪酶,实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出胰 酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提 取出菠萝蛋白酶,缺点：,要有充足的原材料，广泛应用受到限制,2、酶的生产,（1）组织提取法,方法：采用一定的技
2、术直接从动植物或微生物 的组织、细胞中将酶提取出来,优点：,简单易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值,（2）发酵法,方法：通过微生物发酵获得所需要的酶,胞外酶：从发酵液中直接提取；胞内酶：将细胞弄碎再经过提取纯化而 得到。,易培养、繁殖速度快、便于大规模生产,优点：,提取方式：,（3）化学合成法,缺点：,成本高、已知分子结构的酶,方法：通过微生物发酵获得所需要的酶,提取出来的酶还要经过分离、纯化，再加入适量的稳定剂和填充剂，制成相应的酶制剂后才能用于催化化学反应。,3、酶的提取和分离纯化,（1）酶的提取,盐溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法,适宜的温度和pH和保护剂,方法：,
3、（2）酶的分离提纯,沉淀技术（密度梯度离心法）,层析技术,条件：,课题背景,2、酶制剂的缺点：（1）酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件 非常敏感，容易失活；（2）溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高 了生产成本；（3）反应后会混在产物中，可能影响产品质量。,1、酶制剂的优点：催化效率高、低能耗、低污染等。,课题背景,3、设想：两项技术（1）设想一：固定化酶技术固定化酶技术:用物理或化学方法将酶固定在一定空间 内的技术。常用方法是将酶固定在不溶于水的载体上；优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还能被反复利用；缺点:一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中
4、很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。实例：用固定化酶技术生产高果糖浆。,3、设想：两项技术（2）设想二：固定化细胞技术固定化细胞技术：用物理或化学方法将细胞固定在一定空间内的技术。在固定化酶技术的基础上，发展出了细胞固定化技术，将细胞固定在不溶于水的载体上反复使用。固定化细胞常用的载体:常用的不溶于水的多孔性载体优点：可催化一系列化学反应，成本更低，操作更容易；（相对于酶的固定化）缺点:固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降。本课题：制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。,一、基础知识,（一）固定化酶及应用实例,1、固定化酶,固定化酶是指限制或固定于
5、特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。,2、固定化酶技术生产高果糖浆,（1）高果糖浆：是指果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人类的健康更有益。,（2）生产原料：,葡萄糖，葡萄糖是由淀粉转化而来,是以酶解法催化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖（含量在42%左右）而组成的一种混合糖糖浆。,（3）生产原理：,葡萄糖,果糖,葡萄糖异构酶,这种酶稳定性好，可持续发挥作用，但在溶解于葡萄糖溶液后，无法从糖浆中提
6、取回收，浪费很大。,使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出。,（4）生产过程,（3）生产优点,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。目前用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨。,（二）固定化细胞技术,利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间的技术。,1、固定化酶和固定化细胞技术：,2
7、、酶和细胞固定化方法,（1）物理吸附法：,方法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法；固体吸附剂：多为活性碳、多孔玻璃等,（2）包埋法：,方法：将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型,载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺,种类,凝胶包埋法：将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状 聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚 合物中，这样作可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶脱落的情况。,微囊化法：将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既可以使酶存 在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微 囊外环境接触。小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产 物也能扩散出来。,交联
8、法：通过双功能试剂，将酶和酶联结 成网状结构的方法。,（3）化学结合法：,将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式。,种类：,共价结合法：酶和载体以共价键的形式结合在 一起的方法，这种方法需要酶和载体 都具有氨基、羧基或羟基等官能团。,方法：,包埋法,化学结合法,物理吸附法,3、酶和细胞固定方法的选择,酶适合采用化学结合和物理吸附法固定,细胞适合采用包埋法固定,（1）酶和细胞固定方法的选择,（2）原因,细胞个大，个体大的细胞难以被吸附或结,合酶分子很小而个小的酶容易从包埋的材料中漏出,类型,优点,不足,直接使用酶,催化效率高，低耗能、低污染等,对环境条件非常
9、敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量,固定化酶,酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用,一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的,固定化细胞,成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收,固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制,（三）酶制剂、固定化酶和固定化细胞催化的对比,思考：1、从操作角度来考虑，你认为哪一种方法更容易？固定化细胞更
10、容易2、哪一种方法对酶活性影响最小？物理吸附法和化学结合法影响最小，酶与反应物能充分接触。3、固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？是所固定的细胞能产生的一系列酶4、如果想把微生物发酵过程变成连续的酶促反应，应该选择哪中方法？固定化细胞技术5、如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？固定化酶技术；因为大分子物质难以通过细胞膜。,本课题使用包埋法来固定细胞，即将微生物细胞均匀的包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠做载体包埋酵母菌。,1、酵母细胞的活化,（1）过程：称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10
11、ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化,（2）注意事项：,选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一,在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。,二、实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,2、配置物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2 溶液,（1）过程：,称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,（2）注意事项：,溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果,3、配制海藻酸钠溶液,（1）过程：称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加
12、入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml。,（2）注意事项,加热时要用小火，或者间断加热反复几次，直到海藻酸钠溶化为止,海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量：海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少,4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合,（1）过程：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中。,（2）注意事项,溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌。,搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察,5、固定化酵母细胞,（1）过
13、程：以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。,（2）注意事项,可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照,海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚 沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右,（二）用固定化酵母细胞发酵,（1）冲洗:将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的
14、制作成功。在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,1、过程,(2)发酵：150mL10葡萄糖固定化酵母细胞200mL锤形瓶密封25发酵24h。,2、注意事项,（1）控制好发酵温度，一般是室温25,（2）发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显。,（3）可用不含酵母的凝胶珠做相 同的处理做对照实验。,海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化，如果加热太快，海藻酸钠会发生
15、焦糊。,三、操作提示,1、观察凝胶珠的颜色和形状（1）如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海 藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；（2）如形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明 海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。2、观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。,四、结果分析与评价,如果希望反复使用固定化酵母细胞，就需要避免其他微生物的污染。在工业生产中，细胞的固定化是在严格的无菌条件下进行的。结合专题2的无菌操作技术，想一想如果要求制作反复使用的固定化酵母细胞，应该在实验过程中注意那些问题？1、海藻酸钠溶液、CaCl2溶液和各种
16、操作器具灭菌；2、实验过程进行无菌操作。,五、课题延伸,结合专题1中的课题1，想一想，是否可以利用固定化细胞发酵制作果酒和果醋，使用固定化细胞能否达到连续生产的目的？有兴趣的同学不妨试一试。可以利用固定化细胞发酵制作果酒和果醋，使用固定化细胞能达到连续生产的目的。,六、课题延伸,课后习题：P52，习题1,类型,优点,不足,直接使用酶,催化效率高，低耗能、低污染等,对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量,固定化酶,酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用,一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的,固定化细胞,成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收,固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制,
