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1、霉菌毒素的检验,掌握：黄曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理和方法微柱筛选法测定AFTB1的原理及方法赭曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定的原理及方法,熟悉：展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮的测定方法了解：霉菌毒素的命名、分类、危害和污染来源,概述 黄曲霉毒素的检验 赭zh曲霉毒素 展青霉素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇 T-2毒素 玉米赤霉烯酮的测定方法,目录,霉菌及霉菌毒素,霉菌：是丝状真菌的俗称，意即发霉的真菌，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。,常见毒性大的霉菌毒素：黄曲霉毒素（AFT）、杂色
2、曲霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮,霉菌毒素的命名与分类,按照产生毒素的霉菌名称来命名,按毒作用部位分,肝脏毒素肾脏毒素神经毒素类似性激素作用物质,按毒素来源分,曲霉毒素青霉毒素镰刀菌毒素,霉菌毒素的分类,按毒作用机理,抑制蛋白质合成类作用于离子通道类作用于细胞骨架类作用于细胞突触类,霉菌毒素的分类,按毒素结构分,二呋喃环内酯环醌类,霉菌毒素的产生条件,水分 pH 温度 湿度 氧气,霉菌毒性与危害,肝、肾、神经、生殖、消化系统的损害免疫抑制、细胞毒性致癌、致畸、致突变，如黄曲霉毒素能诱发人、猴、鼠、禽类发生肝癌，致癌所需时间最短为24周。,第二节 黄曲霉毒素的检验,
3、黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT),黄曲霉、寄生霉和温特霉的代谢产物 剧毒物，其毒性是氰化钾的10倍，为砒霜的68倍，是目前发现的最强的化学致癌物质之一黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强高温高湿地区生产的花生、玉米、大米、棉籽等最容易被污染,基本结构：二呋喃环和香豆素,产生荧光颜色不同，可分为B族（蓝色）和G族（绿色）两大类及其衍生物,主要存在于牛奶中,AFTB1及其衍生物,AFTG2及其衍生物,黄曲霉毒素的理化性质,耐热，高于280裂解；耐光，不耐氧化剂难溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿在碱性条件下，其结构中的内脂环可被破坏形成香豆素钠盐，该盐能溶于水，无毒。在酸性条
4、件下，能发生逆反应，恢复其毒性。其反应式为：,黄曲霉毒素B1,黄曲霉毒素的分析方法,TLC酶联免疫吸附法（ELISA）微柱筛选法HPLC,国标法,薄层色谱法单向展开法,样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准比较来确定含量。,样品处理,样品加正己烷（或石油醚）和甲醇-水溶液，震荡分层，取甲醇-水层氯仿萃取无水Na2SO4过滤滤液蒸干苯-乙腈溶解备用,点样,在距薄层板下端的2cm基线上用微量注射器滴加样液，标液，一块板滴加4 个点，点的直径3mm，大小一致，在一条直线上。滴加
5、样式如下：第一点第二点第三点第四点样液 20 20 20 l淡标(0.04 g/ml)10 10 l浓标(0.2 g/ml)10 l（最低荧光点）（样点）（荧光定位）,预展及展开,预展，12cm,展开1012cm,观察及确证,365nm,若Rf=0.6附近有蓝紫色荧光,确证,点样后，在点样处滴加三氟乙酸,Rf=0.1附近有蓝紫色荧光,展开、紫外灯下观察,AFTB1AFTB2a极性增大,确证点样操作,第一点第二点第三点第四点样液l 20 20淡标（0.04 g/ml）10 10 三氟乙酸 1小滴小滴（反应5min，热风吹2min，40）,定量操作方法,第一点第二点 第三点 第四点样液 10 15
6、 20 l淡标 10 l,0.0004g,（0.04 g/ml）,定量操作方法,如样点的荧光强度与淡标点的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为0.0004g如样点的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升，直至样点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。,高效液相色谱法测定AFTB1,样品中的黄曲霉毒素经C18柱分离，用带荧光检测器的高效液相色谱仪检测，以保留时间定性，峰面积或峰高定量。,样品提取,样品粉碎加少量水氯仿提取无水Na2SO4脱水过滤提取液，待净化,样品净化和衍生物反应,硅镁型吸附剂,1.提取液2.氯仿-正己烷 氯仿-甲醇3.丙酮-水洗脱,
7、洗脱液水浴蒸干氯仿溶解部分加入正己烷、三氟乙酸静置30min氮气吹干用流动相溶解进高效液相色谱仪,高效液相测定参考条件,检测器：荧光检测器 激发波长：360nm 发射波长：425nm色谱柱：C18流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（1+1）或乙腈-甲醇-水（50+150+300）流速：1.3ml/min,微柱筛选法P130,样液中黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂层吸附后,在365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的浓度范围内成正比例关系。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。,GB/T 5009.23-2006
8、,玻璃微柱管：内径0.4cm，长12cm,为便于加液可在管的上部接一段粗的管口。微柱层析架：附有接受洗脱废液的容器，要尽可能密闭。,下层甲醇水提取液,花生油,振摇,石油醚甲醇-水,氯仿,下层,弃去水层，洗去残留甲醇,过滤,备用,无水硫酸钠,水,黄曲霉毒素的提取甲醇-水-石油醚提取法,下层萃取液,玉米磨碎,润湿,氯仿,过滤,备用,无水硫酸钠,黄曲霉毒素的提取三氯甲烷水提取法,甲醇-水,微柱管制备,脱脂棉（铺顶层）3cm 无水硫酸钠（60100目）1.5cm酸性氧化铝12.5cm中性氧化铝0.5cm无水硫酸钠0.5cm硅镁型吸附剂0.5cm无水硫酸钠脱脂棉（作底层）,微柱层析,1ml液体,样液,0
9、.0025g/ml标液,0.005g/ml标液,氯仿,展开剂：丙酮三氯甲烷（1:9）,结果观察与评定,365nm紫外光照射 若样品柱管内硅镁型吸附剂层只现微黄色荧光环，则样品中黄曲霉毒素含量为未检出(在5或10gkg以下)；若出现蓝紫色荧光环，则需进一步通过薄层色谱测定法进行测定。,确证时，不需重新提取样品其操作如下：准确吸取原三氯甲烷提取液于小蒸发皿内挥干，以少量苯乙腈混合液(982)分数次转入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确证，并测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的含量。,需要说明之处,层析用的氧化铝、硅镁型吸附剂及无水硫酸钠使用前应在120活化2 h，装瓶盖严
10、于干燥器内，可保存1周左右，超过1周需再次活化层析结束后，最好在2h内观察接受洗脱液的容器要密封,第三节 赭曲霉毒素A的检验,赭曲霉毒素的理化性质,由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及绿青霉等产生的一类毒素。赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。OTA微溶于水、石油醚，加碱成盐，水溶解性增大酸性时，溶于苯、氯仿。对紫外线不稳定，几天即分解（应避光）,用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液-液分配后，根据其在365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。采用双相展开法,薄层色谱法,GB/T 5
11、009.96-2003,氯仿层,样品粉碎,过滤,氯仿磷酸,NaHCO3,水层,氯仿层,蒸干,备用,苯-乙腈,盐酸氯仿,提取（甲法）,甲醇-水层,样品粉碎,过滤,石油醚甲醇-水,氯仿层,震荡,氯仿层,备用,苯-乙腈,NaCl饱和溶液,提取（乙法）,氯仿,点样、纵展,展开剂：无水乙醚乙醚-甲醇-水,纵展23cm,横展,展开1012cm,样品+标液,展开剂：无水乙醚乙醚-甲醇-水,纵展,展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水甲苯-乙酸乙酯-甲酸苯-冰乙酸,纵展1315cm,观察及确证,365nm,与标准点的相应处有黄绿色荧光,确证,用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒色谱板，室温下干燥,紫外灯,OTA荧光点应由黄绿色变
12、为蓝色,稀释定量,比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。薄层板经双向展开后，当样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点。,在横展过程中，原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了。,稀释定量,这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概略定量,方法说明,本标准规定了谷物和大豆中OTA的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆
13、中OTA的测定。薄层板上OTA的最低检出量为4ng。本方法的最低检测量为10g/kg。标准使用液冰箱黑纸避光,第四节 展青霉素的检验,一、展青霉素的理化性质无色结晶，熔点110，在70-100可升华；溶于水和乙醇；在碱性条件下不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐热。二、食品中的来源主要存在于腐烂水果及其制品中展青霉素由荨麻青霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌代谢产生的。,三、毒性与危害四、卫生标准五、分析方法展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。我国的标准分析方法为双向薄层扫描定量测定法。,双相薄层扫描测定法,用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳酸钠净化样品，经双向薄层分离后，利用薄层扫
14、描仪进行紫外反射光扫描定量。,本方法适合于苹果、山楂制品及其半成品中展青霉素的测定,GB/T 5009.185-2003,薄层扫描仪,展青霉素的提取,果汁：加乙酸乙酯，振摇2min，静置分层。重复以上步骤两次，合并有机相。有机相加碳酸钠，振摇1min，静置分层后，弃去碳酸钠层，再用碳酸钠重复处理一次。提取液滤真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，加三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。,展青霉素的提取,鲜苹果、果酱：苹果洗净、削皮、打碎置研钵中，加无水硫酸钠研磨后转至锥形瓶加乙酸乙酯浸泡、振荡，过滤滤液减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。,薄层分
15、析 点样,标液与样液相差3cm 在样品点用一垂直线上，距顶端2cm处点20ng的标准液，为位置参考点。,固定相：硅胶GF254,薄层分析 双向展开,先横向，排除杂质的干扰，再纵向在波长254nm紫外灯下观察，展青霉素Rf值约为0.35，若样品点出现黑点，则样品为阳性。根据样液黑色吸收点的强度高低，稀释不同倍数后，再点样10L，使每个样品点展青霉素的绝对量在10100ng之间，经双向展开后，进行扫描定量测定。,确证,阳性样品的验证：将阳性样品的薄层色谱板喷以MBTH显色剂，130烘烤15min，冷却至室温后，于波长360nm紫外灯下观察，展青霉素应呈橙黄色点。,定量,测定波长270nm；参考波长
16、310nm；反射光测定；扫描速度40nn/min；记录仪纸速20nn/min；根据标准及样品中展青霉素峰面积，按下式计算样品中展青霉素含量。,X果汁中展青霉素含量，g/mL；Y鲜苹果中展青霉素含，g/g；c展青霉素标准液浓度，g/mL；A样液展青霉素峰面积；,Y,S展青霉素标准峰面积；V加三氯甲烷定容体积，mL；D样液点稀释倍数；m样品质量，g；V1液体样品的体积，mL。,第五节脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验,脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的测定,脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）三羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下无荧光雪腐镰刀菌
17、烯醇（NIV）四羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮易溶于水、甲醇、乙醇等极性比DON大,也称呕吐毒素,分子结构毒性与危害卫生标准主要来源：DON及NIV主要是雪腐镰刀菌污染小麦、玉米、豆饼等粮食和饲料产生的代谢产物。分析方法：我国规定DON的标准分析方法是薄层色谱法（第一法）和免疫测定法（第二法）。其他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。,脱氧雪腐镰刀菌烯醇-薄层色谱法测定,脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。,本标准适合于谷物及其制品,GB/T 5009.
18、111-2003,提取,粉碎样品加水、三氯甲烷-无水乙醇振荡1h过滤滤液蒸干,液液分配 净化,石油醚溶解残渣再用甲醇-水分次洗涤蒸发皿,甲醇-水层,过中性氧化铝、活性炭柱,甲醇-水淋洗柱子,沸水浴浓缩至干,乙酸乙酯溶解，浓缩，备用,点样、展开、测定,先点样液横展：使DON偏离原点（杂质）展开剂：乙醚-丙酮或无水乙醚 对于小麦制品，还须再用10mL石油醚横展一次。加点标准液后纵展开 展开剂：三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8:1:1)三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5:1:1.5:0.1),薄层上端与样品点相对应的位置点一个DON标准点，作为定位参考,观察,365nm杂质有荧光 DON无荧光而后薄层板在
19、130加热，冷却后如DON处无荧光，则为阴性杂质、DON均有荧光，但是刚好分开，为阳性,定量,阳性样品与不同量的标准点一起进行薄层色谱分析，比较样品与各标准点DON点荧光强度，进行概略定量。,薄层色谱法（DON，NIV）,小麦中的DON，NIV经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使DON，NIV在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。,样品提取、净化,粉碎甲醇-水提取二次过滤加石油醚取甲醇水层浓缩加水稀释待净化,XAD-4色谱柱净化甲醇洗脱,测定,同前只是展开剂不同,第六节 T-2毒素的检验,由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大
20、麦、玉米等粮食作物及其制品 难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯,T-2毒素的检验,本标准适合于谷物及其制品,GB/T 5009.118-2008,高效液相色谱测定法间接ELISA法直接ELISA法,HPLC,试样中的T-2毒素用甲醇-水提取后，提取液经免疫亲和柱净化，浓缩、衍生、定容后，用配有荧光检测器的液相色谱仪进行测定，外标法定量。,免疫亲和柱净化,测定的基础是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品净化液缓慢的通过T-2毒素免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱T-2毒素，然后进行后续操作。,提取、净化,样品加甲醇-水、高速均质离心上清液滤纸过滤滤液用水稀释玻璃纤维滤纸过滤进免疫亲和柱净化,待衍生氮气吹干收集洗脱液1.5ml甲醇洗脱弃去全部流出液水淋洗柱子,衍生,净化后的样品二甲基氨基吡啶（催化剂）和氰酸蒽混匀，50反应，冷却氮气吹干流动相乙腈-水溶解进液相色谱测定,第七节 玉米赤霉烯酮的检验,玉米赤霉烯酮的测定,用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。,玉米赤霉烯酮的测定,试样中的玉米赤霉烯酮用乙腈-水提取后，经免疫亲和柱净化、浓缩后用配有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定，外标法定量。,
