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1、中华人民共和国卫生行业标准WS/T 4912016梅毒非特异性抗体检测操作指南Guideline of test method of non-specific antibodies fortreponemal pallidum infection2016-07-07 发布2016-12-15 实施中华人民共和国卫生和计划生育委员会发布目 次! II 細i2规范性引用文件12 术语和定义13 01, 15检测原理15.1 臓15.2 67 26仪器耗材26.1 微量移液器26.2 水平旋转仪26.3样品采集器36.4 样品H器 36.5 反应板36.6专用抗原滴针37 样品采集和P存37.1 采
2、集处理37.2 样品检查47.3保存48 试验操作步骤48.1 48.2 RPR/TRUST-定性试验58.3 RPR/TRUST-半定量试验58.4 VDRL 试验59 结果描述和表示79.1 定性试验79.2 半定量试验79.3 报告格式710质量控制710.1 基本要求710.2 对照品810.3 质控品8104反应板810.5 专用滴针910.6 结果判定910.7 室内质量控制和室间质量评价9II 临床意义9111辅助诊断911.2 疗效监测912 艮& 1012.1 鍵1012.2假阳性反应1012.3 假阴性反应1012.4 前带现象1012.5 血清固定1012.6 血浆样品1
3、0附录A (规范性附录)抗干扰性能初步评估11附录B (规范性附录)抗干扰性能评估验证厂家声明12 13U刖本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准起草单位:上海市皮肤病医院、上海市临床检验中心、复旦大学附属中山医院、中国疾病预防 控制中心性病控制中心、上海市疾病预防控制中心。本标准起草人:顾伟鸣、杨阳、王庆忠、郭玮、尹跃平、吴磊、薛以乐。梅毒非特异性抗体检测操作指南1范围本标准规定了梅毒非特异性抗体检测的方法、试验操作步骤、结果描述与表示、质量控制等。本标准适用于开展梅毒非特异性抗体检测的各类实验室。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,
4、仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。JJG 6462006 移液器3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。血清固定 sero犪st少数患者经过足量驱梅治疗,梅毒非特异性抗体维持在相对恒定的低滴度状态。注1:判断血清固定,应具备3个要素:流行病学病史和临床表现排除复发、重新感染;连续2个随访周期(6月) 血清抗体维持在1滴度范围之内的低滴度水平(一般3 yL血液,或含有4X109/L12X109/L红细胞)。7.3保存7.3.1血浆或血清样品在4h内检测,可置室温存放;5个连续工作日内检测,分离样品可置2C8C 存放;否则应置一20C
5、或更低温度保存。7.3.2 CSF样品在4h内检测,可置室温存放;5个连续工作日内进行检测,样品可置2C8C保存, 不可冻存。8试验操作步骤8.1 总述如使用商品化试剂盒,应遵照试剂盒说明书结合所在实验室实际情况编写标准操作程序(SOP),并 经性能验证有效。检测时严格按SOP进行操作。48.2 RPR/TRUST-定性试验RPR/TRUST定性试验用于筛查梅毒非特异性抗体。操作步骤如下:a) 吸取50 yL待检血清或血浆样品、对照品、质控品,每个样品置于反应板上的一个圆圈中;b) 将样品涂布充满整个反应圆圈;c) 滴加抗原前,试剂瓶沿水平方向旋转,将抗原混勻,用滴针轻缓地反复吹吸数次,直至抗
6、原充分 悬浮,吸人滴管;d) 弃去针管中第1滴抗原,从第2滴开始向每个样品圈中滴加1滴抗原;e) 滴加抗原后,立刻拿起反应板,倾斜30左右旋转数次,让抗原和样品尽快混合;f) 将卡片置于水平旋转仪上,启动仪器的反应程序(100r/mm,8mm);g) 当仪器停止工作后,3 mm之内用肉眼观察结果;h) 按照9.1给出的定性试验反应结果的描述作出判断。注1:涂布样品时移液头与卡片的夹角接近30避免移液头划破反应板表面防水涂层。注2:本案以专用抗原滴针为例(下同)。混匀抗原悬液时不可剧烈吹吸。保持垂直状态、以自由落体方式滴加抗 原。不可使用最后一滴抗原滴加到样品中。针管中的抗原将用尽时,按8.2c
7、)、8.2d)给出的描述重复操作。注3:定性试验呈阳性反应的样品,应将样品连续的倍比稀释后,进行半定量试验。8.3 RPR/TRUST-半定量试验RPR/TRUST半定量试验用于判定梅毒非特异性抗体相对浓度、和(或)排除前带现象。操作步骤 如下:a) 吸取50 yL生理盐水,分别加至反应板上数个连续的圆圈中;b) 吸取50 yL待检血清样品(或对照品、或质控品),与反应板上第1个圆圈的生理盐水充分混 合,稀释过程中,样品与生理盐水应反复吹吸6次,避免气泡,不可将样品吹出反应圆圈;c) 吸取第1个圆圈中倍比稀释的样品50 yL,与反应板上第二个圆圈的生理盐水充分混合;d) 重复吸取前一个圆圈的5
8、0 yL稀释样品与后一个圆圈中生理盐水混合的操作,至最后一个生 理盐水的圆圈充分混合后,吸出50 yL的稀释样品,弃用;e) 从最高稀释度开始往低稀释度方向,逐一将稀释样品均勻地涂满整个圈;f) 按8.2c)、8.2d)给出的描述和步骤滴加抗原;g) 按8.2e)和8.2f)给出的描述和步骤启动反应程序的操作;h) 当仪器停止工作后,3 mm之内用肉眼观察最高稀释度出现9.1.3或9.1.4反应结果的描述作 出判断,以+或士表示检测结果;1)半定量试验应做到最终稀释度。8.4 VDRL 试验8.4.1抗原工作液配制在试验前应配制VDRL抗原的工作液。新鲜配制的抗原工作液检测血清时8h内有效,检
9、测CSF 时2h内有效。操作步骤如下:a) 吸取VDRL抗原稀释液0.4mL,加人容量为30mL的带盖、底部直径35 mm的平底玻璃瓶, 缓慢倾斜小瓶使VDRL抗原缓冲液覆盖整个瓶底;b) 吸取VDRL抗原0.5mL,一边平缓地沿水平方向转动玻璃瓶(以3r/s的速度绕5 cm的圆周 直径旋转),一边在位于玻璃瓶的上1/3处,在6 s内连续地将0.5mLVDRL抗原逐滴地流人 到抗原缓冲液中;c) 最后一滴抗原滴出后,再持续转动玻璃瓶ls;d) 吸取抗原稀释液4.lmL,沿瓶壁加人(不可直接滴至抗原中);e) 盖上瓶盖,ls内上下颠倒30次,抗原呈均勻悬浮后,即为抗原工作液;f) 每次试验时平缓
10、地旋转含抗原工作液的小瓶,让抗原均勻悬浮。8.4.2 VDRL定性试验-血清样品VDRL定性试验用于筛查血清中梅毒非特异性抗体。少数境外患者在初诊时采用VDRL试验,人 境后进行疗效随访时宜采用VDRL进行血清样品的试验。操作步骤如下:a) 血清样品应灭活处理(56C,30mm),灭活后的血清样品超过4h检测,应在试验前重新快速 灭活处理(56C,l0min);b) 吸取50 yL血清,在专用反应板上均勻地涂满整个反应圆圈;c) 按8.2c)、8.2d)给出的描述和步骤滴加抗原;d) 将反应板固定在水平旋转仪上,启动仪器的反应程序(180 r/min,4min);e) 当仪器停止工作后,5 m
11、m内在显微镜下观察凝集状态(10倍目镜,10倍物镜);f) 按照9.1给出的定性试验反应结果的描述作出判断。8.4.3 VDRL半定量试验-血清样品半定量试验用于判定血清中梅毒非特异性抗体相对浓度、和(或)排除前带现象。操作步骤如下:a) 按8.4.2a)处理血清样品;b) 按照8.3a)、8.3b)、8.3c)、8.3d)和8.3e)给出的步骤稀释样品;c) 按8.2c)、8.2d)给出的描述和步骤滴加抗原;d) 将反应板固定在水平旋转仪上,启动仪器的反应程序(180 r/min,4min);e) 当仪器停止工作后,5mn之内在显微镜下观察最高稀释度出现9.1.3或9.1.4反应结果的描 述
12、作出判断,以+或士表示检测结果。8.4.4 VDRL定性试验-CSF样品VDRL定性试验用于筛查CSF中梅毒非特异性抗体。CSF样品不需灭活处理。操作步骤如下:a) 吸取50 yLCSF,注人专用反应板(CSF)上的反应圆圈;b) 按8.2c)、8.2d)给出的描述和步骤滴加抗原;c) 将反应板固定在水平旋转仪上,启动仪器的反应程序(180 r/min,8min);d) 当仪器停止工作后,5mn内在显微镜下观察凝集状态(10倍目镜,10倍物镜);e) 按照9.1给出的定性试验反应结果的描述作出判断。8.4.5 VDRL半定量试验-CSF样品半定量试验用于判定CSF中梅毒非特异性抗体相对浓度、和
13、/或排除前带现象。操作步骤如下:a) 按8.3a)、8.3b)、8.3c)、8.3d)和8.3e)给出的步骤稀释样品;b) 按8.2c)、8.2d)给出的描述和步骤滴加抗原;c) 将反应板固定在水平旋转仪上,启动仪器的反应程序(180 r/min,8min);d) 当仪器停止工作后,5mn之内在显微镜下观察最高稀释度出现9.1.3或9.1.4反应结果的描 述作出判断,以+或士表示检测结果。9结果描述和表示 9.1定性试验9.1.1强阳性反应:RPR/TRUST肉眼(VDRL镜下)显见团块状的絮状凝集物,悬液背景清亮。以“ + +”或“+ + +”格式表a;9.1.2阳性反应:RPR/TRUST
14、肉眼(VDRL镜下)显见比较小的絮状凝集物,悬液背景较清亮。以“ + +”格式表a;9.1.3弱阳性反应:RPR/TRUST肉眼(VDRL镜下)可辨细小散在的絮状凝集物,悬液背景浑浊。以 “+”格式表a;9.1.4临界阳性反应:RPR/TRUST肉眼(VDRL镜下)可辨较粗糙的抗原颗粒,悬液背景浑浊。以 “士”格式表a;9.1.5阴性反应:RPR/TRUST肉眼(VDRL镜下)抗原颗粒均勻分布。以“一”或“阴性”格式表示。9.2半定量试验呈现弱阳性反应或临界阳性反应的最高稀释倍数,为半定量试验的滴度。以1: X+或1: X士格 式表示(其中X为稀释倍数值)。9.3报告格式9.3.1阴性反应的检
15、测报告应有“试验方法”(如RPR或TRUST或VDRL)和“结果表示”两部分组成。示例:VDRL-(阴性)注:原始样品定性试验符合9.1.5给出的细节。提示:阴性反应。9.3.2阳性反应的检测报告除了试验方法外,还应有“定性”原倍)和“半定量”滴度)结果共3个部分组成。示例 1 : RPR+ + + +,:64 +示例 2: TRUST,1 :256 +注1 :原始样品定性试验符合9.1.1给出的细节;半定量试验中,经过连续稀释至1:128符合9.1.5给出的细节,而 1:64符合9.1.3给出的细节。提示:定性试验强阳性反应,无前带现象,呈高滴度状态,半定量试验已经至最 终稀释度。注2:原始
16、样品定性试验符合9.1.5给出的细节;半定量试验中,经过连续稀释至1:512符合9.1.5给出的细节,而 1:256符合9.1.3给出的细节。提示:定性试验有前带现象,呈高滴度状态,半定量试验已经至最终稀释度。10质量控制10.1 基本要求10.1.1 试验温度10.1.1.1 试验区域温度宜在18C29C之间。10.1.1.2所有从低温环境下取出的标本、试剂、对照品、质控品等,应放置在室温至少30 mm才可以进行试验。10.1.1.3过低的环境温度可增加假阳性。10.1.2生物安全本文件涉及传染性生物样品,应注意生物安全防护。10.1.3 隐私保护本文件涉及性传播感染,应保护患者信息和试验结
17、果等个人隐私。10.1.4技术人员10.1.4.1技术人员应有医学检验专业教育背景,上岗前应获得性病实验技术的培训资格证,在岗期间 应定期参加专业知识的复训。10.1.4.2在岗人员应定期进行能力测试。10.1.4.3对缺乏经验的技术人员,可将高滴度的样品进行连续稀释,观察每个反应圆圈中的抗原抗体 凝集状态,根据9.1给出的细节,掌握辨别弱阳性结果的能力。10.2对照品10.2.1对照品应随试剂盒保存,不可冻存。10.2.2不同试剂盒中的对照品不可混用。10.2.3对照品不可作为监测检测质量稳定性的质控品。10.2.4应记录每次对照品的检测结果,并保存记录。10.2.5每一次试验时,应随待检样
18、品同步检测阳性反应和阴性反应的2种对照品。10.2.6对照品检测符合预期结果,说明本次检测有效。10.2.7对照品检测不符合预期结果,说明本次检测无效,应进行重复检测。10.2.8如重复检测仍然不符合预期结果,提示该试剂盒失效,应更换新试剂盒。10.3质控品10.3.1质控品为已知阳性反应的血清制品。有适当敏感度、明确的指定值(半定量试验时滴度通常为 1:8)。性状的稳定期应1年。10.3.2每一个批次的质控品,至少可满足一年的检测用量,应置于螺口带密封胶圈的冻存管中一20C 或更低温度保存。每一支分装保存体积500 pL。10.3.3连续5个工作日内使用的质控品,应置于2C8C保存,避免反复
19、冻融。10.3.4应记录每次实验时质控品的指定值、批号、生产日期、失效日期、当日检测结果,并保存记录。 10.3.5每个工作日至少一次,随待检样品、对照品同步检测质控品。10.3.6质控品的检测符合预期结果,表明检测系统受控,检测有效。可发送临床样品检测报告。10.3.7质控品的检测不符合预期结果,本次检测失控。不可发送临床样品检测报告。查找整个检测 系统的试剂、技术和管理等的失控原因。纠正失控后,可发送报告。10.4反应板10.4.1 VDRL专用反应板重复使用前应洁净处理。10.4.2反应板正面是样品的反应区,避免直接接触和污染。10.4.3 RPR/TRUST试剂盒打开后,纸质反应板应保
20、存在干燥的室温下,不可置于冰箱保存。10.4.4纸质反应板表面覆盖塑料涂层有适当的表面张力。即液体在反应圆圈内既不会自由流动,也 不会呈荷叶上露滴状。如发生不能均勻地涂布样品到整个圆圈,应更换反应板。10.4.5反应板应整体平坦,储藏和检测时不会凸起或凹陷。10.5专用滴针10.5.1初次使用的专用滴针,应检查是否符合6.6.2和6.6.3给出的要求。保存检查记录。10.5.2当日检测完成后,宜用蒸馏水或去离子水冲洗针管。不要擦拭针头,这样会磨损硅涂层,可能 影响滴加抗原的准确性。10.5.3每6个月更换专用滴针。10.6结果判定10.6.1使用纸质反应板替代玻璃片进行VDRL试验时,反应结束
21、后吸取反应液置载玻片上,覆上盖玻 片,在显微镜下观察。10.6.2应在明亮的光线下,肉眼观察RPR/TRUS了结果。不可使用显微镜观察。10.6.3少数样品在检测后发现反应圆圈的周边均勻悬浮着细小颗粒凝集,而中心部位呈现阴性反应。 可手持反应板倾斜30,轻轻地转动数次,可帮助识别临界阳性反应的结果。10.6.4临床诊断提示早期梅毒/或疑似早期梅毒病例的样品,即使定性试验呈阴性反应,也应将样品 稀释到1:16进行半定量试验。通过半定量试验来排除前带现象。10.6.5当判断为前带现象时,应进一步稀释样品进行检测,报告最终滴度。有前带现象的患者,免疫 应答系统机制更容易发生贾-赫氏反应(Jamch-
22、Herxhernierreacturn),检测报告中应包含前带现象的信 息(按9.3.2给出的规定),有利于临床医生采取适当措施来降低诊疗风险。10.6.6当无前带现象时,报告中应注明已经过1:16稀释,呈阴性反应。10.7室内质量控制和室间质量评价10.7.1应开展梅毒血清学的室内质控。10.7.2应每年至少2次参加由专业管理机构组织的室室间质量评价活动。10.7.3定性试验的检测结果与预期值一致,为合格。半定量试验的检测结果1:8,部分早期梅毒和潜伏梅毒的滴度2个滴度(例:从1:64下降至1:16,4倍),判断治疗有效。抗体下降2个滴度,并且连续2个监测周期的定性试验呈阴性反应,判断治愈。
23、抗体滴度下降2个稀释度,或上升2个滴度(例:从1:16上升至1:64,4倍),或定性试验从阴性反应转变成阳性反 应,应结合流行病学史和临床体征,可判断复发、或再感染、或治疗失败。12局限性 12.1概述虽然VDRL、RPR、TRUST的检测原理基本相同,但因采用的抗原原料和生产工艺的不同,各种方 法和试剂之间可能存在一定范围的敏感性和特异性的系统性差异。任何2种方法的定性和半定量结 果,相互间不可直接比较。当采用梅毒非特异性抗体作梅毒筛查用途时,应选择敏感性高的方法或 试剂。12.2假阳性反应12.2.1个别品牌真空采血管中含有的添加剂成分,可干扰检测结果引起假阳性反应。12.2.2与梅毒感染
24、无关的其他因素,如急性和慢性疾病、自然组织损伤等,梅毒非特异性抗体试验也 可呈阳性反应。常见的疾病因素有系统性红斑狼疮、麻风病、疟疾、传染性单核细胞增多症、病毒性肝 炎、肿瘤、其他螺旋体疾病等可引起假阳性反应。常见的生理性因素有孕妇、老年人群可发生假阳性反应。12.3假阴性反应12.3.1感染梅毒螺旋体后,机体免疫应答需要一定过程,抗类脂质的抗体浓度尚处于实验方法的检测 限之下,称为窗口期。可发生假阴性反应。12.3.2少数早期梅毒和神经梅毒以及部分晚期梅毒,可发生定性试验假阴性反应。12.4前带现象部分早期梅毒(1%2%二期梅毒、0.5%1%期梅毒)的样品可出现前带现象。12.5血清固定部分
25、晚期潜伏梅毒、少数其他病程的样品可发生血清固定现象。12.6血浆样品12.6.1血浆中的抗体浓度显著高于血清,同一个患者血清与血浆的检测结果不可直接比较。12.6.2用血浆进行检测时,应在样品类型中注明“血浆”。12.6.3血浆样品不可做VDRL试验。12.6.4仅在特殊情况下,用RPR/TRUST检测血浆样品。如:血库、无离心机的实验室、无法获得血 清样品的状况。附录 A(规范性附录)抗干扰性能初步评估A.1干扰物质可能来自内源或外源物质。常见的异常标本(例如溶血、黄疸及脂血)、标本处理过程中 的添加物(例如抗凝剂、促凝剂)、采集及处理过程中接触标本的物质(例如标本收集容器及塞子)。A.2向
26、真空采集器生产商,了解添加剂的成分及其对检验项目的抗干扰性能。主要添加剂成分不明确 的真空采集器,应谨慎选择。A.3向梅毒非特异性抗体检测的试剂盒生产商,了解对常见干扰物质的抗干扰性能。A.4从国家和地区质量控制管理部门,获得试剂盒、真空采集器抗干扰试验的质量评估信息。附录犅(规范性附录)抗干扰性能评估一-一验证厂家声明B. 1 基本要求B.1.1应使用新鲜样品进行抗干扰性能评估。B. 1.2应选择具有溯源性的干扰物质标准物质,进行抗干扰性能评估。包括:游离型胆红素(BU.F)、结 合型胆红素(Bil.C)、溶血素(Hb)和乳糜微粒(CM)。B.2验证真空采集器的抗干扰能力B.2.1选择10例
27、健康人和10例不同病程的梅毒病例。梅毒病例应包含3份临界水平、3份低滴度、 4份高滴度的样品。B.2.2使用1种无添加剂的洁净玻璃管作对照。B.2.3拟选真空采集器和对照管同时采集一个受检者静脉血,分离血清或血浆。B.2.4分别进行梅毒非特异性抗体检测的定性和半定量试验。B.2.5比较检测结果差异情况,判断真空采集器的抗干扰能力。B.3验证试剂的抗干扰能力B.3.1选择被评估试剂。B.3.2样品选择符合B.2.1规定。B.3.3静脉抽血,分离血清或者血浆备用。B.3.4干扰物质的标准物质复溶后,按照最高生理浓度水平,与待检的血清或血浆样品混合。B.3.5对添加干扰物质前后的血清或血浆样品,分别
28、进行定性和半定量试验。B.3.6比较同一个受检者,添加干扰物质前后的样品,检测结果的差异情况。B.3.7综合判断该试剂抗干扰物质的能力。B.4 判断标准B.4.1以对照管的检测结果为标准,含添加剂的真空采集器的样品,梅毒非特异性抗体的定性试验无 相反的结果;半定量试验的结果1滴度。判断真空采集器具有抗干扰能力。B.4.2以不加干扰物质的原始样品的结果为标准,含干扰物质的血清或血浆的样品,梅毒非特异性抗 体的定性试验无相反的结果;半定量试验的结果1滴度。判断该试剂具有抗干扰能力。参考文献I 顾伟鸣,杨阳,吴磊,等.梅毒血清学试剂性能评估方案的优化及应用.医学检验,2014 29(11): 116
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