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1、天然药物化学实验实验一 大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别 一、实验目的 1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。 2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。 3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。 4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。 5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。 二、实验原理 1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim. ex Reg.和药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄蒽醌及其苷。 大黄酸(rhein) 分子式C15H8O6，分子量284.21。黄色针状结晶，m
2、p.321322，330分解。能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。 大黄素(emodin) 分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256257，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。 芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式C16H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶，mp.223224。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。 大黄酚(chrysophanol) 分子式C15H10O4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜结晶，mp.196197，能升华。易溶于沸乙醇
3、，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。 大黄素甲醚(physcion) 分子式C16H12O5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，mp.203207，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。 OHOOHR2OR1大黄酚 R1=CH3 R2=H 大黄素 R1=CH3 R2=OH 大黄酸 R1=COOH R2=H 大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H 2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯
4、仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。 三、实验仪器与试剂 1.索氏提取器，500、100、10ml烧杯，1000、500ml分液漏斗，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，1020cm薄层板，1020cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯，玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱 2.大黄粗粉，滤纸，pH试纸，乙酸乙酯，石油醚，氯仿，20硫酸，pH8缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，
5、5碳酸钠，5氢氧化钠，丙酮，10氢氧化钠，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂：石油醚-乙酸乙酯-甲酸上层溶液，浓氨水。 四、实验步骤 1. 提取与分离 大黄粗粉100g 加20硫酸200ml，300ml， 加氯仿500ml，回流3h，稍冷，过滤 氯仿提取液 药渣 水洗余酸至中性 氯仿提取液 加pH8缓冲液150ml萃取或5%碳酸氢钠溶液萃取数次 碱水液 氯仿提取液 20%盐酸调pH3，静置，滤过 加pH9.9缓冲液300ml萃取或5%碳酸钠溶液萃取数次 沉淀 冰醋酸精制 氯仿提取液 碱水层 大黄酸 5碳酸钠 0.25氢氧化
6、钠 20%盐酸调pH3，滤过 -5氢氧化钠 萃取数次 沉淀 540ml萃取 丙酮精制 大黄素 氯仿提取液 碱水层 5氢氧化钠200ml分两次萃取 20%盐酸调pH3，滤过 沉淀 碱水层 氯仿提取液 醋酸乙酯精制 20%盐酸调pH3，滤过 芦荟大黄素 沉淀 硅胶柱色谱 大黄酚 大黄素甲醚 2检识 碱液试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。 乙酸镁试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。 薄层色谱检识 薄层板：硅胶H-CM
7、C-Na 试 样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。 对照品：上述各成分对照品乙醇溶液。 展开剂：石油醚-乙酸乙酯-甲酸上层溶液。 显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。 五、基本操作注意事项 1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。 2.为了验证分离所采用的萃取液是否合理，作如下缓冲纸色谱试验：取层析滤纸3 cm12 cm，距下端2 cm处划一起始线，向上每隔1.5 cm划一平行线，在各条带上依pH由低至高顺次涂布实际所用的各缓冲液及碱液，涂布完后，将湿滤纸夹
8、在两片干滤纸中吸至半干。取样品总蒽醌苷元氯仿提取液点在起始线上，用氯仿上行展开，将结果绘制在下面图中，并确定选择的萃取剂是否合理。 3.pH梯度萃取法分离羟基蒽醌，是利用羟基蒽醌的酸性不同，可溶于不同pH的碱液中，在分离时，应注意萃取的次数不宜过多，否则被分离的成分间回游混杂，最好同时用薄层对照。所用碱液的pH值分别如下：5%碳酸氢钠为8，5%碳酸钠为10-11，0.5%氢氧化钠为12以上。一般萃取大黄酸用pH78范围的，萃取大黄素用pH9.511范围的。 4.若用缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。 5.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎
9、杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。 6.硅胶柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚 装柱：用石油醚乙酸乙酯浸泡200300目硅胶约20 g，搅拌均匀，尽量赶出气泡。一次性倒入1.8 cm * 28 cm 的层析柱中，轻轻敲打使硅胶均匀下沉，至硅胶界面不再下降为止。 上样：将离大黄酚和大黄素-6-甲醚的混合物用乙醇加热溶解，伴入少量硅胶，水浴60左右烘干，加到已装好的硅胶柱顶端，最后在样品带上盖上一层硅胶或棉花，以保护样品界面不受干扰。 洗脱：先用100 ml石油醚乙酸乙酯洗脱，至第一条黄色色带洗下来，再换用100 ml石油醚乙酸乙酯洗脱下第二条色带。先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿醋酸乙酯(82)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。 六、思考题 一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。 二、大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？ pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？ 蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？ 蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？
