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1、制药工艺学,Pharmaceutical Technology,疫苗制备工艺,第一节 疫苗概述第二节 疫苗制备主要技术第三节 细菌性疫苗制备工艺第四节 病毒性疫苗制备工艺,第一节 疫苗概述,一、疫苗概念二、疫苗的组成三、疫苗的发展四、疫苗制备的基本过程,1、疫苗(Vaccine）的概念,类预防类生物制品；通过免疫机制预防疾病概念：通过注射或黏膜或口服接种，诱导机体产生对特定病原体的特异性抗体或细胞免疫，获得保护或消灭治疗该病原体的能力。特殊性：用于健康人群，婴幼儿和儿童为主要求：绝对安全,疫苗的分类,组分疫苗,是用单一组分制备的疫苗。类毒素疫苗：用丧失毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗，如白
2、喉类毒素、破伤风类毒素亚单位疫苗：病原微生物的表面抗原成分制成的疫苗，如乙肝表面抗原疫苗。脂多糖疫苗：胰蛋白酶水解伤寒杆菌制备。优点：减少了机体的反应缺点：分子量小，抗原性弱，要加入佐剂，增强免疫效果。,联合疫苗,能预防多种疾病的联合制剂，不同抗原进行物理混合后制成。多联疫苗：用于预防不同病原体引起的疾病，如白百破联合疫苗。多价疫苗：用于同一病原体的不同菌株或不同血清型引起的同一疾病，如肺炎多糖疫苗，由23种不同血清型的细菌多糖组成，只能预防肺炎链球菌。特点：多种免疫原性和稳定性的抗原，接种途径简便，一次接种产生多种疫苗肺炎。结合疫苗是化学方法将两种以上抗原相互偶合制成的疫苗,二、疫苗的组成,
3、1）抗原：减活或灭活的病毒或细菌、或提取物、有效成分等。2）佐剂：能特异性地与抗原结合，增强免疫应答反应的物质，无毒安全。金属盐类，铝佐剂和油制佐剂。如Al(OH)3，弗氏佐剂。3）防腐剂：防止外来微生物污染。硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿等。4）稳定剂：乳糖、明胶、山梨醇等。5）灭活剂：丙酮、酚、甲醛等。6）其他成分：缓冲液、盐等。,三、疫苗发展简史,1721:英国医师 Edward Jenner，感染牛痘的人不会再感染天花。1796:Jenner，将挤奶员手上的牛痘溃疡接种8岁男孩手臂，未感染天花。疫苗接种开始。1798：医学界正式接受疫苗预防疾病。1884：Pastuer，第一个病毒减活疫苗
4、狂犬病疫苗。1885：Ferran，霍乱肉汤培养物，开始疫苗的注射。1870：Pasteur，第一个细菌减活疫苗鸡霍乱疫苗1897：Wright制成伤寒全菌苗。,三、疫苗发展简史,1901：von Behring，发现白喉毒素，获得诺贝尔奖。1909：Calmetee和Guerin在甘油胆汁马铃薯培养基上，传代230代，制成减毒活疫苗，即卡介苗。1955：脊髓灰质炎灭活疫苗生产。1986：重组乙肝疫苗生产。1990：B型流感嗜血杆菌疫苗，多糖结合疫苗生产。1995：水痘疫苗、无细胞型百日咳疫苗生产。2000：结核肺炎球菌疫苗生产。,四、疫苗制备的基本过程,对菌毒株进行优化和筛选，建立合格完善的
5、毒种库,制备的疫苗需进行生化和免疫及安全性检定或动物实验，确定其安全性和免疫原性。疫苗制备的生产人员、厂房、实验动物及其他条件要严格遵循GMP的要求和管理。,在完全控制条件下，进行菌体或细胞培养，合成抗原。,收集菌体或细胞，破碎、过滤、色谱等制备抗原,加入适当的佐剂或生理缓冲体系制剂成型。,第二节 疫苗制备的主要技术,灭活技术减活技术质量控制,一、灭活技术,灭活是破坏微生物的生物学活性，使其丧失感染力和致病性，尽可能最大限度保留免疫原性和抗原性。灭活剂：灭活微生物的试剂与化学物质。物理方法，化学方法,一、灭活技术,加热：使蛋白质变性失活，病原体失去传染能力。菌毒液于水浴（5660），维持1小时
6、。受热要均匀，注意不同病原体的耐热性。如霍乱疫苗、布氏菌制剂、假单胞杆菌疫苗等。紫外线：使核酸形成TT二聚体，失去遗传功能。最大限度保留了完整抗原性和免疫原性，但灭活程度不完全，有光复活的可能性，未在实际中应用。,物理方法灭活,一、灭活技术,甲醛，-丙内酯，磷酸三丁酯，丙酮，乙烯亚胺，双乙烯亚胺，戊二醛，硫柳汞。甲醛灭活：破坏蛋白质的结构，使核酸烷基化。过程复杂，有时抗原性受到破坏，但病原体仍然存活。在实际操作中要严格控制各种条件，如温度、浓度、时间和pH等，保证疫苗的安全和稳定性。甲醛一般浓度为0.2-0.4%。可灭活多种病毒和细菌，乙脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、人巨噬病毒
7、、甲肝病毒和HIV等，伤寒杆菌、棒状杆菌、绿脓杆菌。,化学方法灭活,二、减活技术,减活：使强菌株、毒株转化为弱毒株，残留毒力达到隐性感染，但不诱生临床症状的安全有效的程度设计上要在毒力和免疫原性之间平衡，残留毒力达到安全性和有效性，而不诱发疾病。毒力与免疫原性具有一定相关性，毒力越大，免疫原性越强。过度减毒将导致失去免疫原性。,体外减活温敏性突变化学诱变,体外减活技术,体外减活：连续传代减活。病毒可在单一宿主中反复传代，也可在异源宿主中繁殖连续传代登革热病毒在狗肾或非洲绿猴肾细胞上系列传代减毒，达到人用安全性。卡介苗，传代230代，得到一株致病力完全丧失的活菌株。,冷适应性减活技术,冷适应性稳
8、定减毒策略：低温下能生长，失去毒力，达到减毒目的。病毒表现型和体内减毒定向选择，连续或分段培养，低温下的冷适应株或温度敏感株。流感病毒野毒株适应在较低温度下生长，使其不能在较高温度下复制，来达到减毒的目的。如H2N2毒株32在鸡胚传20代，在25传17代，28传8代，25传22代，获得了更加减毒的冷适应株。呼吸道合胞病毒：低温下连续传代减毒。,冷适应性减活技术,温度敏感性突变：不同温度下生长，进行筛选用化学诱变剂处理或从感冒野毒株中筛选，使毒株不能在38繁殖，而只能在37复制，只能在上呼吸道繁殖，以产生抗体，获得免疫，却不能在下呼吸道繁殖，以免引起流感症状。,化学诱变减活技术,化学诱变策略：对
9、病原微生物进行诱变，获得突变株。注意减毒不够或防止反祖现象。营养缺陷：伤寒杆菌Ty21a口服减毒活疫苗。,基因工程减活技术,基因工程减活：不同类型的突变和减活位点组合，遗传重组、基因重配。基因缺失活：将与毒力有关的基因删除，缺失突变，达到减毒。主要用于DNA病毒，如腺病毒。遗传重组：强弱毒株之间的基因交换和重组。两种毒株同时感染细胞，在细胞内发生基因重配，在子代筛选出重组病毒。对分节RNA病毒适合。流感、汉坦、轮状病毒等。,基因工程减活技术,感冒病毒减活：基因重配策略野毒株H3N2与长期实验室适应PR8重配，使重配株具有冷适应株的特性，HA和NA基因来自H3N2野毒株，而其余基因节段来自PR8
10、毒株野毒株与温敏株重配，使重配株变成具有温敏特性，其表面抗原HA和NA基因是野株的；,三、疫苗质量控制,物理化学性质检定安全检定效力检定,1、理化性质,外观，真空度、溶解时间。外观：液体制剂，无色透明，无异物、凝结快和沉淀物；混悬液制剂，乳白色悬液；冻干制剂，白色、淡黄色疏松体，海绵状或结晶状，无冻融现象。封口和包装严格。防腐剂含量：苯酚低于0.5%0.25%，氯仿低于0.5%,游离甲醛低于0.02%。纯度：蛋白质疫苗，测定有效成分含量，计算比活性。真核产品纯度达98以上，原核产品纯度达95。残留水分测定，Al(OH)3测定。,细菌、病毒株和主要原材料的检查：半成品检查：是否有杂菌或有害物质的
11、污染，灭活剂、防腐剂是否过量，活菌毒处理是否完善。产品检查：逐批进行，无菌试验，纯毒试验，毒性试验，热源试验，安全性试验等。,2、安全性检定,动物保护力（免疫力）试验：免疫动物后，再用野生菌或毒株攻击动物，判断免疫保护的水平。活疫苗效力测定：细菌苗以制品中抗原菌的存活数表示其效力，稀释菌液，涂布平板，计数计算活菌率。活病毒疫苗以病毒滴度表示，用50细胞培养法感染量CCID50表示，疫苗稀释后，接种于传代细胞，培养检测CCID50。血清学试验：体外抗原抗体试验、凝集反应、中和反应、补体结合反应等。,3、效力检定,基本过程培养方法吸附百白破联合疫苗制备,第三节 细菌性疫苗制备工艺,一、细菌性疫苗制
12、备的基本过程,减活疫苗,二、菌体的培养方法,不同细菌的培养基成分的不同，培养方式基本相同固体培养或液体培养取第一代培养物在大试管中扩大培养，再转种于大克氏瓶（每瓶装100120 mL琼脂培养基），经培养后刮取菌苔悬于生理盐水中。灭活疫苗：经灭活后，稀释成一定浓度减活疫苗：不杀菌，加适宜保护剂后制成，冷冻干燥的剂型。,1.原液：百日咳疫苗原液，白喉类毒素原液，破伤风类毒素原液，氢氧化铝佐剂2.半成品配方1ml：百日咳杆菌不高于9 X 109个菌；白喉类毒素不高于20Lf；破伤风类毒素不高于5Lf3.半成品配制：注射水稀释氢氧化铝成1-1.5mg/ml，加硫柳汞（不高于0.1g/L），NaCl含量
13、至8.5g/L。按计算量，将各疫苗原液加入氢氧化铝稀释液内，pH5.8-7.2，无菌检查合格。4.成品：分批、分装、不同规格，包装。成品检定，保存（2-8度避光，有效期18个月）,三、吸附百白破联合疫苗制备,1菌种：百日咳杆菌（Bordetella pertussis）I相，培养特性、血清学特性、皮肤坏死试验、毒力及免疫力试验符合中国药典要求。,2.原液制备生产用种子：35-37C培养不超过72h,以后各代不超过48h,传代菌种保存不超过14d，工作种子批不超过10代。,百日咳疫苗原液制备工艺,2.原液制备固体培养工艺：活性炭半综合琼脂培养基的克氏瓶中48h，不锈钢刮棒逐瓶收集菌苔至PBS缓冲
14、液（pH7.0-7.4）中。灭活：加入0.1甲醛，于37存放23 d杀菌；或加入0.04甲醛处理12 d后，再以56加热30 min。检验：原液经纯菌试验和无菌试验合格后，保存于48 冷库，原液需放置34个月，待解毒完全3.检定：各项指标合格后，才可用于配制联合疫苗,百日咳疫苗原液制备工艺,白喉类毒素疫苗原液制备工艺,1、菌种：白喉杆菌PW8株2、生产用种子：工作种子批传代扩大，再传代到产毒培养基种子管，再传代到产毒培养基生产用培养基：胰酶牛肉消化3、液体培养，严格控制杂菌，白喉杆菌产生毒素4、收获：过滤或离心，收获上清，毒素效价不低于150Lf/ml絮状单位5、脱毒：用甲醛脱毒6、精制：用硫
15、酸铵、活性炭二段盐析等方法7、脱毒检查与检定：符合药典规定,破伤风类毒素疫苗原液制备工艺,1、菌种 破伤风梭状芽孢杆菌2、生产用种子：工作种子批在产毒培养基种子管中传代，再传代到产毒培养基，制成生产用种子 生产用培养基：酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白质经水解后制备3、液体培养，产生毒素，严格控制杂菌4、收获：过滤或离心，收获上清，毒素效价不低于40Lf/ml絮状单位5、脱毒：用甲醛在适宜温度下脱毒，脱毒检查6、精制：用硫酸铵、超滤、等电沉淀等方法7、原液检定：符合药典规定,基本过程甲肝疫苗流感疫苗基因工程乙肝疫苗,第四节 病毒性疫苗制备工艺,一、基本制备工艺过程,二、甲肝疫苗制备工艺,人成纤维二
16、倍体细胞培养：单层，接种毒种再培养34周，收获病毒液，冻融、超声处理，过滤，提纯，甲醛灭活，Al(OH)3吸附，成品。原代地鼠肾细胞培养：接种培养，收获病毒液，甲醛灭活，过滤，成品。Vero细胞培养（欧洲）：Vero单层细胞，转瓶培养，收获后灭活（80PEG），蔗糖密度梯度超速离心纯化，成品。,三、三价(H3N2和H1N1亚型及乙型毒株)纯化流感疫苗制备,鸡胚接种流感疫苗毒种,收获培养液,超滤和密度区带离心,透析脱糖,33-37,48-72h,甲醛灭活,超滤除菌,原液检定,1:1:1合并,半成品检定,分装,成品检定,病毒疫苗,四、基因工程重组乙肝疫苗制备工艺,表达系统与成品酿酒酵母(Sacch
17、aromyces cereviae)汉逊酵母（Hansenula polymorpha）CHO细胞配方：乙型肝炎病毒表面抗原，氢氧化铝佐剂,生产菌种：主种子批扩增一代为工作种子批；检验符合药典规定,原液制备发酵：工作种子批菌种，进行三级发酵，收获酵母菌，冷冻保存。对培养物纯度、质粒丢失率等检定，于-60度保存不超过6个月。纯化：破碎细胞，硅胶吸附粗提，疏水色谱纯化，硫氰酸盐处理，稀释过滤后，为原液。,重组乙肝疫苗制备（酿酒酵母）,半成品制备甲醛处理：100ug/ml甲醛，37度下处理适宜时间。铝吸附：按一定比例，加入铝剂，2-8度下吸附；无菌生理盐水洗涤，去上清，为铝吸附产物。配制：20-27ug/ml铝吸附产物，与铝佐剂等量混合。,重组乙肝疫苗制备（酿酒酵母）,成品制备分批、分装、规格、包装检定，合格,小结与思考题,1、疫苗有哪些种类，有何优缺点？2、疫苗减活和灭活的原理是什么？3、制备疫苗的基本工艺过程是什么？,疫苗制备工艺,谢谢！,
