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1、生物选修三生物选修三(现代生物科技).txt25爱是一盏灯，黑暗中照亮前行的远方；爱是一首诗，冰冷中温暖渴求的心房；爱是夏日的风，是冬日的阳，是春日的雨，是秋日的果。DNA重组技术的基本工具 培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二：形成重组DNA 关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞 一、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶 1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来 2、种类：4000种 3、作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 4、结果：形成两种末端：黏性末端和平末端
2、大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 二、基因的针线DNA连接酶 DNA连接酶连
3、接形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 不同点 连接DNA片段 连接游离的脱氧核苷酸 不需要模板 需要模板 相同点 连接不同脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖 导入过程需要运输工具运载体 运载体必须同时满足四个要求： 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 具有多个限制酶切点，便于与目的基因结合； 具有某些标记基因，便于筛选。 对受体细胞无害，易分离 运载体的作用： 1、作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。 常用的运载体：质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等 质粒 质粒是基因工程最常用
4、的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。 质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。 基因工程的基本操作程序 基因的结构 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质 编码区：能够转录为相应的信使RNA，进而指
5、导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质 真核细胞的基因结构 外显子: 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子: 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA 信使RNA前体 信使RNA 真核细胞的基因在转录时内含子和外显子是一起转录的，因而转录产生的mRNA必须经过加工，将内含子转录部分剪切掉，将外显子部分拼接起来，才能成为有功能的成熟的mRNA。原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的mRNA不需要剪切、拼接等加工过程。 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具
6、有调控作用的非编码区组成的 基因工程操作的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 目的基因的制备 ? 目的基因就是所需要克隆的外源基因 ? 制备方法： 1、人工合成法 2、逆转录法 3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中离 4、用PCR法扩增目的基因片段 5、从基因文库中获取 目的基因的制备：人工合成法 ? 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得 ? 人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的 ? 缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高 目的基因的制备：逆转录法 ?
7、若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。 ? 该法是：以编码某特异多肽的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNA的互补DNA；再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA。 可用于真核生物目的基因的获得 ? 用逆转录法合成cDNA的主要问题是： 1、mRNA必需提得很纯 2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物， 3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的dscDNA，这与实验技术有关。 用限制酶切法直接从染色体DNA中分离 ? 此方法主要适用于制备原核基因 ? 对于物理图谱已清楚的原核基因，可
8、用限制酶把目的基因切出来 ? 鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部DNA片段插入到载体DNA中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的DNA片段。 用PCR方法扩增目的基因片段 ? PCR是聚合酶链反应的缩写 ? 是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术 ? 在有少量DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制DNA变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的DNA链，新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板。理论上经n次循环后，DNA链
9、可达2n 利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称聚合酶链式反应 ，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 原理：DNA复制 条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、引物、耐高温DNA聚合酶 方式：以指数 方式扩增，即2n 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 过程： A、DNA变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA B、退火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 C、延伸：在DNA聚合酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。 D、多次重复 (一)从基因文库中获取目的基因 2.基因文库的构建方法 鸟枪法：(直接分离
10、法) 反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因 优点 缺点 鸟枪法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 反转录法 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 根据已知氨基酸合成DNA法 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 (二)基因表达载体的构建 核心 1.用一
11、定的限制酶 切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2.用同一种限制酶 切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组 DNA分子 4.过程: 5.基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？ 基因的特点 要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在 植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。 要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物 (三)将目的
12、基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法 农杆菌介绍 原理及适用范围 2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序： 3、将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理受体细胞成为感受态细胞,再进行混合 (四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功 使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白的设计： 从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列 将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠
13、杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中 培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白 基因工程的应用 转基因生物 目的基因 目的基因从何来 抗虫棉 Bt毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌 抗真菌立枯丝核菌的烟草 几丁质酶基因和抗毒素合成基因 抗盐碱和干旱作物 调节细胞渗透压的基因 耐寒的番茄 抗冻蛋白基因 鱼 抗除草剂大豆 抗除草剂基因 增强甜味的水果 甜味基因 降低乳糖的奶牛 肠乳糖酶基因 生产胰岛素的工程菌 人胰岛素基因 人 二、植物基因工程硕果累累 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。 1、抗虫转基因植物 方法：从某些
14、生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性 目的基因包括：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 ? Bt毒素对哺乳动物无毒害作用，被广泛地用来构建抗虫转基因作物。 ? 植物凝集素是一种糖蛋白或结合糖的蛋白质，存在于多种植物中，特别是富含于植物种子和储藏器官。 抗病毒转基因植物 ? 病毒外壳蛋白转基因植物 ? 病毒复制酶转基因植物。 3、抗逆转基因作物 4、利用转基因改良植物的品质 方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性。 三、动物基因工程前景广阔 1、用于提高动物生长速度 目的基因：生长
15、激素基因 2、用于改善畜产品的品质 ? 就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？ 转基因动物的乳腺。 ? 为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？ 1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产 物 5、用转基因动物生产药物 1、用动物乳腺作为反应器，生产高价值的蛋白质比工厂生产的优越之处有哪些？ A、产量高；B、质量好；C、成本低；D、易提取 2、用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？ 6、用转
16、基因动物作器官移植的供体 供体动物：猪 存在的难题：免疫排斥 解决方法：将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 7、基因工程药品异军突起 工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。 我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等 利用微生物生产药物的优越性何在? 所谓利用微生物生产蛋白质类药物，是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因，构建成表达载体后导入微生物，然后利用微生物发酵来生产蛋白质类药物。 优越性： 利用活细胞作为表达系统，表达效率高，无需大型装置和大面
17、积厂房就可以生产出大量药品。 可以解决传统制药中原料来源的不足。 降低生产成本，减少生产人员和管理人员。 在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接在生物体的哪些结构中提取？ 药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。 传统生产方法的缺点 由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。 可利用什么方法来解决上述问题？ 利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品 ? 基因工程药品 干扰素 干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内
18、提取。 现在可在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素。 四、基因治疗曙光初照 1、体外基因治疗：从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。 2、体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。 ? 用于基因治疗的基因种类 A.从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。 B.反义基因。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA 进行互补，来阻断蛋白质合成。 C.编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫做自杀基因。 蛋白质工程的崛起 人类蛋白质组计划：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝
19、脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划” 一、 蛋白质工程崛起的缘由 提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。 ? “后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。 ? 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。 一、蛋白质工程崛起的缘由 1、基因工程在原则上只能生产自然 界已存在的蛋白质 2、天然蛋白质不一定完全符合人
20、类生产和生活的需要 蛋白质工程的目的：生产符合人们生产生活需要的并非自然界已存在的蛋白质 1）干扰素在体外保存困难 解决方法 ： 半胱氨酸 丝氨酸 玉米中赖氨酸的含量低 解决方法 ： 天冬氨酸激酶：苏氨酸 异亮氨酸 二氢吡啶二羧酸合成酶：天冬酰胺 异亮氨酸 二、蛋白质工程的基本原理 、蛋白质工程的目标 、蛋白质工程流程图 蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？ 基因工程是遵循中心法则，从DNAmRNA蛋白质产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。 蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列，可以创造自
21、然界不存在的蛋白质。 蛋白质工程的前提条件： 了解蛋白质的结构和功能之间的关系 方法： X射线衍射法-测定蛋白质分子的三维结构 核磁共振法-蛋白质的溶液构象 对蛋白质的改造： 造出自然界不存在的全新蛋白质 替代一个肽段或一个特定的结构域 改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基 应用 高蛋白质的热稳定性 改变蛋白质的活性 合成嵌合抗体 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。 植物细胞工程 细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照
22、人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。 2.1.1植物细胞工程的基本技术 为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株？利用什么原理呢？ 细胞的全能性 什么叫做细胞全能性？动物细胞具有全能性吗？ 具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。 细胞为什么会具有全能性呢？ 生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 生物体所有细胞全能性都一致吗？ 受精卵生殖细胞体细胞;植物细胞动物细胞 为什么植物的花瓣在植物体内没有能发
23、育成完整的植株呢？ 基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。 植物细胞在什么条件下才能表现出全能性呢？ 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。 怎样把植物的一个花瓣培育成完整的植株? 外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官 细胞脱分化：就是让已经分化的细胞，经过诱 导后失去其特有的结构和功能而转变成未分 化细胞的过程。 愈伤组织：排列疏松而
24、无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状的薄壁细胞。 再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 一、植物组织培养技术 1、植物组织培养的过程 植物组织培养的培养基 ? 定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质 ? 无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素 ? 有机营养成分 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的蔗糖 琼脂：起支持作用 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 ? PH值：5.06.0 流程：外植体 愈伤组织 根、芽 植株 1.决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么 植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成。
25、当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。 2.在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？ 避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。 3、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？ 胡萝卜根形成层容易诱导成愈伤组织，其他部分如叶、花也能培养成小植株，只是稍微困难些。 4、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养？ 在有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。 5、为什么在再分化的过程中需要光照？ 芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件 植物组织培养条件： 含有全部营养成分的培养基、一定的
26、温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。 概念： 植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 二、植物体细胞杂交技术 1、过程 去壁的常用方法：酶解法 原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇 白菜甘蓝的优点：生长周期短：耐热性强和易于贮藏 在一定程度上克服远缘杂交不亲和的障碍 2、概念 将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 3、成果和未解决的问题 成果：克服不同生物远缘杂交的障碍，出 现自然界没
27、有的新品种。 未解决的问题：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性状 体细胞杂交尚存在一些问题： 由于是两个物种的全部遗传物质的合并，各种基因都在其中，选择符合需要的个体难度大 缘关系越远，染色体排斥丢失的现象就越严重 有时缺乏选择杂种细胞的有效方法 为什么“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？ 主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很
28、自然的了。 植物细胞工程的实际应用 一、植物繁殖的新途径 1.微型繁殖 (1)微型繁殖技术:快速繁殖优良品种的植物组织培养技术. (2)特点: 保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖. 2.作物脱毒 (1)材料:无病毒的茎尖 (2)脱毒苗:切取茎尖进行组织培养获得 3.神奇的人工种子 人工种子是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面包被着特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植物幼体 具有正常发育能力的材料通常是指胚状体或不定芽或顶芽或腋芽 产生途径: 由已脱分化的外植体直接产生； 由愈伤组织产生； 由悬浮细胞培养产生 基本要求: 播种后能快速出苗；根和芽几
29、乎同时生长，不产生愈伤组织；同步化程度高；活力强；形成的幼苗的形态与生长要正常 “外面包被着特定的物质”是指人工种皮 针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。 要求：能保持胚状体的活力，有利于贮藏运输和萌发 人工种子优点：可以完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；可以很方便地贮藏和运输。 生产流程：诱导植物愈伤组织 体细胞胚的诱导 体细胞胚的成熟 体细胞胚的机械化包裹 贮藏或种植 二、作物新品种的培育 1.单倍体育种 (1)方法:花药的离体培养 (2
30、)优点: 后代稳定遗传,都是纯合体; 明显缩短育种年限. 2.突变体的利用 (1)产生:植物组织培养 (2)利用:筛选对人们有利突变体,进而培育新品种 三、细胞产物的工厂化生产 种类:蛋白质,脂肪,糖类,药物,香料,生物碱等. 技术:植物的组织培养 培养对象：愈伤组织或其他易分散的组织 目的:获得人类所需的细胞次生代谢产物 动物细胞培养 1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？没有 、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？是 、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？ 成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖 、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？ 先用剪刀剪碎,后用胰
31、蛋白酶或胶原蛋白酶处理 、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？ 胰蛋白酶水解蛋白质 细胞间的成份是蛋白质 、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂 、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能 、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？ 注意时间的控制 、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近 、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？ 胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛 11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？ 易于培养细胞贴壁，
32、进行生长增殖 12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。 13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？ 将贴满培养瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养 14、如何理解原代培养和传代培养？ 上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养 15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？不都能 16、有些为何能一直传下去吗？发生突变，朝着癌细胞方向发展 17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？不是 18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？ 保
33、存10代以内的细胞，因为1050部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展 ? 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 ? 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 ? 细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 ? 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 ? 细胞株和
34、细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。 概念：动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 动物细胞培养条件： 1、无菌、无毒的环境 2、营养：葡萄糖、氨基酸、促生因子、无机盐、维生素、动物血清等 为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 目的是补充合成培养基中缺乏的物质。 3、温度和PH 36.5+0.5度, PH为7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2CO2的作用是：维持培养液的PH 培养器：培养皿或松盖培养瓶 4.动物细胞培养技术的应用 ? 大规模培养生产生物制品 ?
35、 作为基因工程中的受体细胞 ? 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 ? 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据 植物细胞和动物细胞培养的比较 细 胞 核 移 植 1、用动物体细胞进行克隆的过程,其实际操作过程是什么？ 动物克隆过程的实际是细胞核移植 过程： 1共分成两大阶段;核移植和胚胎移植 2取卵母 细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状 、核在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。 、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？ 10代以内的细胞一般保
36、持正常二倍体的核型，未突变 3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA来自受体卵母细胞 4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？ 因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性 5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？ 多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆
37、过程是将供体细胞注入受体细胞。 6、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？ 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功 将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便 概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 体细胞核移植技术的应用 1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体 4.保护濒危动物 体细胞核移植技术存在的问题： 许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困
38、难，脏器缺陷，免疫失调等。 动物细胞融合与单克隆抗体 植物体细胞杂交的意义：打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种 一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动 概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞形成一个细胞的过程 1.过程： 一用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示 植物动物细胞融合比 原理:动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是相同的(细胞膜的流动性) 方法:诱导融合的方法类似 (不同之处是用到灭活的病毒作为诱导剂) 用途:是制备单克隆抗体。 细胞融合与融合诱导细胞融合物质 诱导方法：灭活的仙台病毒、聚乙二醇、电激等 思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的
39、病毒需要灭活？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 植物、动物细胞融合的比较 你推测一下动物细胞融合有哪些方面的应用吗？ 利用动物细胞融合技术诱导形成杂交瘤细胞 在生产实际中杂交瘤细胞有怎样的应用？ 生产单克隆抗体 单克隆抗体 抗体概念： 机体受抗原刺激后产生的，并且能与之发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞起源： 起源于造血干细胞。 一部分造血干细胞在骨髓分化成B淋巴细胞。 结论： 1.B淋巴细胞遇到了抗原 会产生抗体 2抗体杀死抗原起免疫作用 B淋巴细胞有什么特点？ B淋巴细胞能产生抗体， 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
40、传统的抗体生产方法是？ 传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体 这样生产抗体缺陷是什么？ 这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。 在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，科学家是怎样解决这一问题的呢？ 骨髓瘤细胞的特点是：在体外大量增殖 B淋巴细胞特点是：抗体生产 单克隆抗体制备过程 单克隆抗体制备需要的条件： 一是能产生单一抗体的效应B细胞。 二是能够无限增殖的骨髓瘤细胞。 应用 可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点 可用于疾病治疗 可用于运载药物 “生物导弹”单克隆抗体药物 制备单克
41、隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？ 哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体 胚胎工程 胚胎工程指对动物早期胚胎或
42、配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需要移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类大各种需求。 ? 操作对象：早期胚胎和配子 ? 技术手段：胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等 ? 理论基础：哺乳动物的受精卵和早期胚胎的发育规律 胚胎工程的建立 一.胚胎移植技术的研究 胚胎移植技术成为许多胚胎工程不可 缺少的基础环节。 二.胚胎移植技术的成功和应用带动和加速了体外受精技术的研究。 三.胚胎移植和体外受精使胚胎分割、性别鉴定、体细胞克隆、转基因胚胎、胚胎干细胞 培养等技术应运而生。 一、 精子和卵细胞的发生 一、
43、精子的发生 (1)场所:精子的发生是在睾丸 内完成的. (2)时期:(雄性动物)从初情期到生殖机能衰退 过程：分三个阶段 第阶段：初级精母细胞的形成是在曲细精管管壁，原始生殖细胞通过有丝分裂产生的 精原细胞 初级精母细胞 精原细胞复制完成后，细胞开始进行第一次分裂，此时的细胞，叫初级精母细胞 第阶段：精子细胞的形成 是初级母细胞经减数分裂的结果 减数第一次分裂：一个初级精母细胞两个次级精母细胞 减数第二次分裂：两个次级精母细胞 分裂成单倍染色体的精子细胞 第阶段：变形 精子细胞形成精子 1.家畜每次射精排出的精子数以亿计，但是通常只有一个精子能够与卵子结合，这能说是一种浪费吗？怎样理解这一现象
44、？ 提示：不是。其一，在自然繁殖的条件下，可以说是动物为繁殖后代、延续物种的一种生理保障机制；其二，在自然条件下，精子从射精部位运行到受精部位，将对精子进行筛选，并致使大量的精子途中死亡，被分解或排除，造成精子大量损耗。最后到达受精部位 的精子只剩百余个，与卵子完成受精的只有一个。 2.精子细胞变成精子的过程中，细胞中很多结构会消失，而细胞核和线粒体都保留下来，对这一现象怎样理解？为什么精子中的线粒体集中在尾的基部？ 提示：细胞核是精子遗传物质储存和复制的场所，也是参与精、卵结合和后代遗传特性与细胞代谢活动的控制中心。而线粒体则是有氧呼吸产生运动能量的场所。精子的线粒体集中于尾的基部形成线粒体
45、鞘膜，是精子维持生存和运动能量的“动力工厂”或“发动 机”。 二.卵子的发生 ? (1)发生部位：卵巢 ? (2)时间：减数第一次分裂是在雌性动物排卵前完成；减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程完成的。 排卵卵泡破裂，卵细胞从卵巢排出的过程称为排卵。 黄体-排卵后，卵泡迅速转变成一个富有血管的腺样结构，即为黄体。可分泌孕激素和雌激素。 卵子受精的标志： 当在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精。 1. 一个卵泡中能形成几个成熟的卵子？ 正常情况下，一个卵泡只能形成一个成熟的卵子。 2. 排卵是指卵子从卵泡中排出，还是指卵泡从卵巢中排出？ 是指卵子从卵泡中排出。 3.刚排出的卵是成熟的卵子吗？它在母体的什么部位与精子受精？ 刚排出的卵子尚未完全成熟，仅完成第一次减数分裂，需要在输卵管内进一步成熟，直到减数第二次分裂的中期才能与精子结合完成受精过程。排出的卵子是在输卵管内与精子受精的。 哺乳动物精子和卵子的发生主要有哪些相似点或不同点？ 相似点： 最初阶段均进行有丝分裂，不断增加生殖原细胞的数量；经过两次减数分裂才能形成精子和卵子。 不同点： 一个精原细胞多个精子；一个卵原细胞 一个卵子；精子形状为蝌蚪状；卵子为球形。多数哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的贮备是胎儿出生前完成的。 三、受精 1.
